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皱边石杉种质资源SSR多态性分析、PS-ID验证与其内生真菌代谢产物研究

禹利君  
【摘要】:石杉碱甲(Huperzine A, HupA)是治疗早老性痴呆(又称阿尔茨海默病(Alzheimer's disease, AD))的重要药物来源。HupA主要存在于石杉科及石松科植物中,含量仅为万分之几至千分之几。这些植物大多生长缓慢,对生存环境要求苛刻。寻找新的生物资源,运用有效的生物技术手段,为生产足量、低成本的HupA临床用药做一些基础应用研究工作,已成为当务之急。对石杉科植物HupA的潜在资源调查获知,湖南分布为新记录,大多集中在原始次生林。如何通过生物化学的途径提高现有石杉科植物HupA的含量,国内外还未见其相关研究报道。 我们对中、日两国采集得到的8个点、40个皱边石杉样本进行其PS-ID分析,从分子水平证实其为石杉科植物,与Huperzia lucidula高度同源:与目前用于HupA天然资源获取的蛇足石杉对比分析其HupA含量,皱边石杉为HupA含量较高的优异资源;探索皱边石杉的组织培养体系,从其组培材料及新鲜植株当中筛选了具有生产HupA潜力的4株内生菌,1株高产四草酸钾的黑曲霉。为后续进行HupA的生物发酵培养提供了可供改造的微生物材料,可望从微生物途径获得HupA纯天然产物;利用黑曲霉发酵生产四草酸钾,可望改变传统的、化学合成方法,以生物发酵的形式得到高产率、无污染的纯品。 第一章皱边石杉种质资源SSR多态性及其PS-ID类型身份分析 为研究收集获得的中、日两国8个点、40个皱边石杉样本的SSR基因型多态性及其PS-ID序列,以Paul G. Wolf等对Huperzia lucidula (Lycopodiaceae)叶绿体全基因组的克隆序列,设计13对SSR引物进行PCR扩增,结果表明:只有P2的第一个样本在HCtSSR6引物的扩增下出现了变异,其它均未发现带型的分离;采用PS-ID通用引物,扩增rpl 16-rpl 14间隔区的核苷酸序列,获得了中日皱边石杉植物的PS-ID序列:t aaaattttat ataaatataa atgcaatgtt tttcactatg aaataattaataataattaa atatttaaaa tagatagatt aacctattct aatttttcct tacaaaaccccccaaaaata aagattttta gggggaatat catttctcta atctaaataa ataaat o与Paul G. Wolf等验证的Huperzia lucidula植物的PS-ID序列完全一致。由此获知,我们收集到的中、日两国部分皱边石杉资源与Huperzia lucidula植物高度同源,均属于同一个科的植物,是值得研究的新的石杉科植物资源。 第二章HPLC法定量研究皱边石杉中HupA的含量 为对比研究与目前用于HupA天然资源获取的蛇足石杉进行比较,建立了皱边石杉中HupA含量的HPLC系统分析方法,并对不同来源的皱边石杉其HupA含量进行定量分析。结果表明:该方法的精密度、精确度、重现性均在HPLC方法学的范围之内,10-12分钟可以分离检测一个样品,实现了样品检测的高效率。运用该HPLC检测分析条件测定皱边石杉中HupA含量,其叶、梗部位的HupA含量与其成熟度密切相关,主要富集在地上部的幼嫩部位。不同小地域环境中皱边石杉HupA含量与其遮荫度密切相关。且HupA含量较蛇足石杉的高,尤其是其茎尖幼嫩部位,其含量最高达600.31μg/g是值得开发研究的又一新资源。 第三章皱边石杉内生真菌的分离鉴定及相关代谢产物的初步研究 为获取天然的HupA药物来源,从皱边石杉新鲜材料及组织培养过程中第二次长菌高峰期的内生菌中,分离、纯化了35个目标内生真菌,对其筛选、发酵培养。结果发现:3号、6号、4和7号组合具有生产HupA的潜力;14号菌具有合成四草酸钾的高产能力。 根据菌落形态及其菌丝体形态观察,可初步推知:3号菌为丛梗孢目(Moniliales)丛梗孢科(Moniliaceae)地霉属(Geotrichum Lk.)的真菌;4号菌为曲霉目(Eurotiales)曲霉科(Eurotiaceae)草根霉属(Thielavia Zopf)的真菌;6号菌为丛梗孢目(Moniliales)丛梗孢科(Moniliaceae)青霉属(Penicillium Lk.ex Fr.)的真菌;7号菌为毛霉目(Mucorales)毛霉科(Mucoraceae)毛霉属(Mucor Micheli)的真菌,14号菌为曲霉目(Eurotiale)曲霉科(Eurotiacea)黑曲霉属(Aspergillus niger)的真菌。 试验中发现具有生产HupA潜力的内生真菌,为后续进行HupA的生物发酵培养提供了可供改造的微生物材料,可望从微生物途径获得HupA纯天然产物;利用黑曲霉发酵生产四草酸钾,可望改变传统的、化学合成方法,以生物发酵的形式得到高产量、无污染的纯品。使之广泛、安全的用于制革、织物整理剂、媒染剂,金属抛光、防锈处理、有机化工原料、催化剂、化学分析等行业。


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