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线粒体ATP酶β亚单位在急性白血病多药耐药中的作用及调控机制研究

杨景柯  
【摘要】:研究背景 急性白血病(AL)是最常见的血液系统恶性肿瘤。对化疗药物产生多药耐药(MDR)是AL患者治疗失败的主要原因。虽然肿瘤细胞MDR的产生机制已经得到广泛研究,一些新的耐药逆转措施也在临床得以应用,但是MDR现象的分子机制仍未能完全阐明,且目前临床的耐药逆转措施治疗效果十分有限。因此,寻找新的耐药环节及分子靶位,并探讨白血病细胞耐药机制及逆转措施,对于提高AL治疗的有效率具有重要的临床意义。 研究表明线粒体不仅控制机体细胞的能量代谢,而且在维持细胞钙稳态,调节细胞凋亡等过程中起着关键作用。线粒体ATP酶是线粒体能量转化的核心酶,其β亚单位(β-F1-ATPase)是氧化磷酸化合成ATP的限速组分。有研究发现β-F1-ATPase在多种实体肿瘤中表达下降。由于线粒体ATP酶表达降低或缺失,可导致细胞氧化磷酸化受阻,ATP产生减少,线粒体相关的细胞凋亡受抑,从而使肿瘤细胞对化疗和放疗产生耐受,并“赋予”线粒体ATP酶与凋亡耐受的化疗耐药相关的新的“含义”。新近研究发现线粒体ATP酶表达下调与结肠癌细胞对5-氟尿嘧啶耐药相关,然而耐药产生的机制并不清楚。近年研究表明,恶性肿瘤细胞中特定基因的启动子区域CpG岛甲基化异常及基因的转录活性改变与MDR的形成存在着内在联系。我们课题组在前期的研究中发现,β-F1-ATPase表达下调与慢性粒细胞白血病(CML)对阿霉素(ADR)耐药有关:进一步研究提示β-F1-ATPase基因启动子区域高甲基化与CML耐药有关。 本研究立足于前期的[作基础,探讨β-F1-ATPase在AL患者原代细胞中的表达与临床疗效及体外对ADR药敏性的关系,以及原代细胞β-F1-ATPase启动子区甲基化对耐药的影响,以期在探索AL新的潜在的耐药机制,定位新的逆转耐药的分子靶点上有所突破。 第一部分线粒体ATP酶p亚单位在急性白血病患者骨髓原代细胞中的表达及与临床疗效和体外药敏的关系 目的:探讨线粒体ATP酶ββ亚单位(β-F1-ATPase)的异常表达在AL患者多药耐药中的作用。 方法:以82例AL患者为研究对象,其中包括51例急性髓细胞白血病(AML)患者和31例急性淋巴细胞白血病(ALL)患者,另设11例骨髓相对正常非血液肿瘤患者作为对照。根据临床耐药诊断标准,将AL患者分为临床化疗敏感组和临床化疗耐药组。分离受试者骨髓单个核细胞(BMMCs)并原代培养。采用实时定量PCR (RQ-PCR)和Western blot方法分别检测AL患者BMMCs中β-F1-ATPase mRNA和蛋白的表达,比较化疗敏感组和化疗耐药组之间β-F1-ATPase mRNA和蛋白表达水平的差异,并动态观察6例AL患者在初治和首次复发时β-F1-ATPase mRNA表达的变化;用MTT法检测化疗敏感和化疗耐药的AL患者BMMCs体外对ADR的敏感性,并分别分析两组AL患者BMMCs中β-F1-ATPase mRNA和蛋白表达水平与体外药敏的相关性 结果:1.β-F1-ATPase mRNA和蛋白在所有AL和对照组BMMCs中均有小同程度的表达。与对照组相比,β-F1-ATPase mRNA和蛋白农达水平在AL患者BMMCs中均显著绛低(P0.01)。 2.与化疗敏感组AL患者相比,化疗耐药组AL患者BMMCs中β-F1-ATPase mRNA和蛋白表达水平均显著降低(P0.05)。 3.与化疗敏感组AML患者相比,化疗耐药组AML患者BMMCs中β-F1-ATPase mRNA和蛋白表达水平显著降低(P0.05)。而在ALL,化疗耐药组BMMCsβ-F1-ATPase mRNA和蛋白水平较化疗敏感组有降低趋势,但差异无统计学意义(P0.05)。 4.6例初次诱导获完全缓解的AL患者BMMCsβ-F1-ATPase mRNA表达水平在疾病首次复发时较初治时呈显著性降低(P0.05)。 5.ADR对化疗敏感组和化疗耐药组AL患者原代BMMCs的平均半数抑制浓度(IC50)分别为O.94μg/mL和7.39μ/mL,化疗耐药组为化疗敏感组的7.9倍。 6.化疗耐药组AL患者BMMCs的β-F1-ATPase mRNA和蛋白表达水平与相应的ADR体外药敏试验IC50值均呈显著性负相关(两者r分别为-0.467与-0.628,P均小于0.05)。 结论:AL化疗耐药组骨髓原代细胞存在β-F1-ATPase mRNA和蛋白表达的明显降低,这一降低与细胞体外对ADR的抵抗存在显著相关性,提示AL化疗耐药与β-F1-ATPase活性下调相关。 第二部分线粒体ATP酶β亚单位基因启动子区CpG岛甲基化与急性白血病临床耐药的关系 目的:探讨β-F1-ATPase基因启动子区CpG岛甲基化状态与AL患者临床耐药的内在联系。 方法:以52例AL患者为研究对象(AML患者34例,ALL患者18例),另设8例骨髓相对正常非血液肿瘤患者作为对照。根据临床耐药诊断标准,将AL患者分为化疗敏感组和化疗耐药组。根据β-F1-ATPase基因启动子区甲基化状况,将AL患者分为甲基化组和非甲基化组。分离骨髓单个核细胞(BMMCs)并原代培养。采用甲基化特异性PCR(MSP)和RQ-PCR分别检测化疗敏感组与化疗耐药组患者BMMCs中β-F1-ATPase基因甲基化状况及mRNA表达,比较化疗敏感组和化疗耐药组之间甲基化阳性率的差异,以及甲基化组与非甲基化组之间β-F1-ATPase mRNA表达的差异;选取11例β-F1-ATPase基因呈完全甲基化且化疗耐药的AL患者,观察其体外培养的BMMCs在应用甲基化抑制剂5-氮杂胞苷(5-Aza)后对ADR耐药逆转情况。 结果:1.β-F1-ATPase基因在8例非血液肿瘤患者BMMCs中均呈非甲基化状态,甲基化阳性率为0。52例AL患者BMMCs中β-F1-ATPase基因甲基化阳性率为55.8% 2. 25例化疗耐药AL患者BMMCsβ-F1-ATPase基因甲基化阳性率为76%,显著高于27例化疗敏感组AL患者(37%)(P0.05)。 3.16例化疗耐药组AML患者BMMCsβ-F1-ATPase基因甲基化阳性率为81.3%,显著高于18例化疗敏感组AML(38.9%)(P0.05)。 4.52例AL患者、34例AML患者和18例ALL患者中,β-F1-ATPase mRNA在甲基化组患者BMMCs中的表达水平均显著低于非甲基化组患者。 5.ADR对11例化疗耐药AL患者BMMCs的IC50在5-Aza干预后(平均值3.14μg/mL)较单用ADR(平均值7.71μg/mL)显著降低(P0.01);其β-F1-ATPase mRNA表达水平在5-Aza干预后(平均值0.0704)较未经干预(平均值0.0458)显著增高(P0.05)。 结论:1.AL化疗耐药组与化疗敏感组β-F1-ATPase基因启动子的甲基化状态存在显著差异。化疗耐药组存在高甲基化状态,并影响β-F1-ATPase mRNA表达。 2.甲基化抑制剂5-Aza可提高耐药白血病细胞对ADR的敏感性,并上调β-F1-ATPase mRNA表达,有望成为AL逆转耐药的一种新的干预措施。


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