盐酸芬戈莫德（FTY720）对EAE大鼠脑和脊髓中P53、ICAM-1表达的影响

【摘要】：目的： 观察盐酸芬戈莫德(Fingolimod, FTY720)对Wistar大鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎(Experimental Autoimmune Encephalomyelitis, EAE)的发病情况、组织病理变化及其脑、脊髓组织中核磷蛋白P53、细胞间粘附分子-1(intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1)表达水平的影响,同时将不同剂量的盐酸芬戈莫德与泼尼松干预的疗效进行比较,观察FTY720对EAE大鼠的防治作用,并探讨其可能的作用机制,为临床上治疗多发性硬化(Multiple sclerosis, MS)药物的选择提供有意义的实验基础依据。 方法： 用豚鼠脊髓匀浆(guinea pig spinal cord homogenate, GPSCH)、完全福氏佐剂(complete freund's adguvant、百日咳疫苗原浆液(pertussis vaccine, PV)共同制成的免疫抗原致敏雌性Wistar大鼠,EAE模型建立后,使用不同剂量的FTY720、泼尼松对各组大鼠进行干预。按照随机的原理将70只雌性Wistar大鼠分成7组：正常对照组10只,EAE组(GPSCH+CFA+PV组)10只、0.03mg/kg·d组(EAE+盐酸芬戈莫德0.03mg/kg·d)10只,0.1mg/kg·d组(EAE+盐酸芬戈莫德0.1mg/kg·d)10只,0.3mg/kg·d组(EAE+盐酸芬戈莫德0.3mg/kg·d)10只1.0mg/kg·d组(EAE+盐酸芬戈莫德1.0mg/kg·d)10只,泼尼松组(EAE+泼尼松5mg/kg·d)10只。将免疫抗原注射日定为第0天,从抗原免疫后第1天开始,正常对照组与EAE组给予生理盐水,其余各组大鼠分别给予不同剂量的FTY720和泼尼松进行干预,直到处死。观察各组大鼠发病情况、体重下降情况及临床症状并进行临床神经功能损伤评分。于大鼠免疫后第18天(相当于EAE组发病高峰期)停止干预并处死所有大鼠。取大鼠脑组织和脊髓腰膨大部位进行组织病理学观察：苏木素-伊红(hematoxylin-eosin, HE)染色后观察炎性细胞浸润情况；罗可沙尔坚牢蓝-焦油紫(Luxol fast blue, LFB)染色后观察髓鞘脱失情况。使用免疫组化技术对各组大鼠脑组织和脊髓腰膨大中的P53和ICAM-1进行检测,使用BI-2000图像分析系统对P53蛋白和ICAM-1的表达进行平均灰度值的测定,获得的各组数据使用SPSS17.0统计软件进行统计学分析。 结果： 1、临床表现观察：①正常对照组大鼠均未发病。②与EAE组比较,0.03mg/kg·d组能延长发病潜伏期、减轻临床症状、减少体重下降p0.05),发病率无明显差异(p0.05),0.1、0.3、1.0mg/kg·d组和泼尼松组大鼠发病率显著降低、潜伏期明显延长、临床症状明显减轻,体重下降明显减少(与EAE组比较,p0.05)。 2、脑组织病理观察：①HE染色：正常对照组大鼠侧脑室周围未见炎性病灶,EAE组大鼠侧脑室周围可见大量炎性病灶(与正常对照组比较,p0.05)；0.03mg/kg·d组炎性病灶数较EAE组减少(p0.05)；0.1、0.3mg/kg·d组与泼尼松组之间差异无显著性p0.05),但均少于0.03mg/kg·d组(p0.05)；1.0mg/kg·d组可见极少炎性病灶,与正常对照组无明显差异(p0.05)。②LFB染色：正常对照组大鼠未见脱髓鞘病灶,而EAE组可见较多典型髓鞘脱失灶。 3、各组大鼠脑和脊髓免疫组化结果：①EAE组P53的表达水平较正常对照组下降(p0.05),EAE组ICAM-1的表达水平较正常对照升高(p0.05)。②不同剂量FTY720组和泼尼松组P53的表达水平上调,ICAM-1的表达水平下降,二者与EAE组比较,p0.05；0.1、0.3mg/kg·d组与泼尼松组之间差异无显著性p0.05),而三者与1.0mg/kg·d组之间均有显著性差异(p0.05)。 结论： 1、FTY720对EAE大鼠发病具有防治作用,且其作用与剂量相关。 2、FTY720通过上调CNS内P53的表达、下调ICAM·1的表达,从而抑制炎症反应,可能是其发挥其防治作用的机制之一。