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BDNF促脊髓前角神经元存活、再生、重塑作用的研究

王知非  
【摘要】:目的:本研究通过构建大鼠坐骨神经损伤动物模型,同时给予BDNF抗体中和内源性BDNF,观察内源性BDNF对脊髓前角神经元的影响,探讨内源性BDNF对脊髓前角神经元保护的可能作用机制。 方法:通过构建大鼠坐骨神经损伤动物模型,设立假手术组、对照组和实验组,实验组腹腔注射BDNF抗体,对照组腹腔注射等量生理盐水,每周2次。每组取6只大鼠分别于7d和14d处死,采用尼氏体染色、TUNEL染色观察处死的大鼠脊髓前角神经元细胞功能及凋亡的情况,并同时采用Western blot检测大鼠脊髓前角神经元Bax、Bc1-2、 Caspase-3蛋白表达水平的改变, 结果:术后7d,尼氏体染色显示假手术组神经元呈正常神经元形态,对照组神经元呈圆形肿胀,尼氏小体减少;实验组大量尼氏体溶解,并可见明显的胞核移位。实验组TUNEL染色阳性神经元数、Bax和Caspase-3蛋白表达水平显著高于对照组(NS)和假手术组(P0.05),而Bcl-2蛋白表达水平显著低于对照组(NS)和假手术组,差异有统计学意义(P0.05)。术后14d,假手术组无显著性变化,对照组胞质内可见有空泡变性,但仍可见少量正常的神经元。实验组神经元尼氏体崩解,甚至消失,神经元结构模糊,存活神经元极少。实验组TUNEL染色阳性神经元数增加了35%,显著高于对照组和假手术组(P0.05)。对照组和实验组Bax和Caspase-3蛋白表达较7d组同时显著增加(P0.05),且实验组Bcl-2蛋白表达显著低于对照组,Bax和Caspase-3蛋白表达显著高于对照组,差异有统计学意义(P0.05)。 结论:BDNF可能参与了坐骨神经损伤后神经元的抗凋亡反应过程,对损伤的神经元有保护作用。 目的:通过构建大鼠坐骨神经损伤模型,研究分析BDNF是否可以影响、调节脊髓前角神经元GAP-43、突触素工和SYN的表达,初步探索内源性BDNF促进神经损伤再生与重塑可能的机制。 方法:通过构建大鼠坐骨神经损伤动物模型,设立假手术组、对照组和实验组,实验组腹腔注射BDNF抗体,对照组腹腔注射等量生理盐水,每周2次。每组取6只大鼠分别于7d和14d处死,分别采用RT-PCR和Western blot观察脊髓前角神经元内GAP-43、突触素Ⅰ以及SYN RNA及蛋白表达的变化。 结果:假手术组大鼠脊髓前角见可见少量GAP-43RNA的表达,但未见GAP-43蛋白表达,对照组可见大量GAP-43、突触素I、SYN RNA及蛋白的表达;实验组脊髓前角内GAP-43、突触素I、SYN RNA及蛋白的表达水平明显低于对照组(P0.05),实验组GAP-43、突触素I、SYN RNA及蛋白表达水平显著高于假手术组,差异有统计学意义(P0.05),7d与14d的结果一致。对照组损伤14d后GAP-43蛋白表达显著高于7d组(P0.05)。各组之间脊髓前角神经元突触素工、SYN RNA及蛋白表达水平7d与14d比较无显著性差异(P0.05)。 结论:BDNF可通过影响脊髓前角神经元内GAP-43、突触素工与突触囊泡素(SYN)的合成及磷酸化,有助于受损神经元功能的修复,促进神经元的再生和重塑。 目的:通过无血清体外培养胎鼠脊髓前角神经元细胞,研究BDNF对体外培养的脊髓前角神经元的影响。 方法:取孕15天的Wistar大鼠,取出大鼠子宫内胚胎,分离脊髓腹侧,制成单细胞悬液,无血清培养。在细胞体外培养7d时,随机将培养的细胞分为实验组BDNF组、BDNF抗体组和对照组,分别在培养液内加入BDNF(终浓度为40ng/ml), BDNF抗体(终浓度30μg/ml)以及等量的PBS液。继续培养5d,利用免疫组化测定NF-200、MAP-2与NSE等神经元特异性标志物对神经元细胞鉴定,并在显微镜下计数存活的神经元细胞数量并观察神经元形态(细胞计数为镜下计数30个视野,取平均值)。采用RT-PCR检测体外培养的神经细胞突触素I.SYN RNA表达水平,采用Western blot对突触素I、SYN、GAP-43、 Akt、磷酸化Akt、bcl-2、caspase-3以及bax蛋白表达水平进行检测。 结果:免疫细胞化学结果发现培养的细胞90%以上NF-200、MAP-2与NSE免疫反应呈阳性。显微镜下计数,对照组、BDNF抗体组以及BDNF组存活神经数分别为42.23±3.26、32.32±2.35、49.23±3.12,BDNF组存活细胞数显著高于BDNF抗体组和对照组(P0.05),对照组细胞数显著高于BDNF抗体组,差异有统计学意义(P0.05)。形态观察发现与BDNF抗体组相比,对照组以及BDNF组神经元胞体大、丰满,细胞突起明显增粗增多,可见到较粗轴突。RT-PCR和Western blot结果发现BDNF组突触素I、SYN mRNA及蛋白水平显著高于对照组和BDNF抗体组(P0.05),对照组突触素I、SYN显著高于BDNF抗体组,差异有统计学意义(P0.05)。三组之间Akt蛋白表达无显著差异,BDNF组磷酸化Akt、bcl-2蛋白水平显著高于对照组和BDNF抗体组(P0.05),bax和caspase-3蛋白显著低于对照组和BDNF抗体组(P0.05),对照组磷酸化Akt、bcl-2蛋白水平显著高于BDNF抗体组,bax和caspase-3蛋白显著低于BDNF抗体组,差异有统计学意义(P0.05)。 结论:BDNF一方面能上调体外培养的大鼠脊髓前角神经元内突触素1与SYN的表达,促进神经元突触的发育、成熟,参与突触重建,有利于受损神经元功能的修复。另一方面可通过活化PI3K/Akt信号途径,有效阻止神经元细胞凋亡,促进体外培养脊髓前角神经元的存活。


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