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常规长方案降调节下PCOS患者的IVF/ICSI-ET妊娠结局及卵泡液差异表达蛋白的分析与鉴定

戴国  
【摘要】:多囊卵巢综合征(poly cystic ovary syndrome, PCOS)是一种临床常见的因月经调节机制失常导致的生殖功能障碍性疾病,育龄期妇女发病率约为5-10%,是导致不孕的一种常见病因。临床以功能性高雄激素血症、持续不排卵和胰岛素抵抗为特征,主要表现为月经稀发、闭经或不规则阴道出血、不孕、肥胖、多毛、子宫内膜过度增生及恶性变化、以及双侧或单侧卵巢呈多囊性改变和某些激素水平的改变等。目前,对于有生育要求的PCOS不孕患者,国内外大多数生殖中心常采用常规长方案降调节来实施对PCOS患者的控制性超排卵(controlled ovarian hyperstimulation, COH),再行IVF-ET或ICSI-ET治疗来助孕。然而,利用常规长方案COH对PCOS患者妊娠结局的影响仍存在争议,其作用机理也不是十分清楚。 为了探索常规长方案COH对PCOS患者IVF/ICSI-ET妊娠结局的影响,并探究其可能的作用机理,本研究进行了以下四个方面的实验:(1)利用回顾性分析的方法,对2009年1月~2010年12月在中信湘雅生殖与遗传专科医院生殖中心接受常规长方案IVF/ICSI-ET治疗的PCOS患者630例共643个周期和正常患者8217例共8617个周期进行了分析,对比了PCOS患者和正常患者的基本特征、促性腺激素(Gonadotropin releasing hormone, Gn)用量、获卵数、受精率、优质胚胎数、临床妊娠率、流产率、抱婴率和中重度OHSS发生率等相关临床指标,探讨了常规长方案COH对PCOS患者IVF/ICSI-ET妊娠结局的影响。(2)利用卵泡液为实验材料,通过调整,优化2-DE技术条件,建立相对稳定的卵泡液蛋白质组2-DE分离和MALDI-TOF-TOF质谱鉴定技术平台。(3)以卵泡液为研究对象,利用2-DE结合质谱技术,探讨控制性促排卵过程中PCOS患者与因男方因素引起不育的正常患者卵泡液蛋白质的差异表达情况,筛选和鉴定与PCOS卵泡发育、妊娠相关的蛋白质,并对这些蛋白质的功能进行生物信息学分析。(4)利用Western blot方法,分析了Alpha-1-antitrypsin、Apolipoprotein A-Ⅰ和Transferrin等部分鉴定的蛋白质在卵泡液中的表达情况;利用RT-PCR方法,检测了Serine/threonine-protein kinase MAK、DNA damage-regulated autophagy modulator protein2、Apolipoprotein A-Ⅳ、 interleukin12A subunit alpha和(?)Serine palmitoyltransferase2等五种新鉴定的蛋白质的:mRNA在颗粒细胞中的表达情况。结果如下:(1)常规长方案降调节下的PCOS患者在接受IVF/ICSI-ET治疗过程中,与正常患者相比,能够获取较多的卵母细胞,其受精率、临床妊娠率和取消率等没有显著性差异,而PCOS患者的流产率和中重度OHSS发生率显著高于对照组,抱婴率显著性低于对照组。(2)通过优化各项实验条件,构建了相对稳定的2-DE和MALDI-TOF-TOF质谱鉴定卵泡液蛋白的技术平台。(3)在PCOS患者卵泡液中筛选出了存在显著性表达差异的蛋白质点32个,并鉴定了其中的20种蛋白质。其中在PCOS患者卵泡液组分中表达上调的蛋白质有Alpha-1-antitrypsin precursor、 Apolipoprotein A-Ⅰ precursor、Transthyretin precursor、Vitamin D-bindingprotein precursor、Haptoglobin precursor、Apolipoprotein A-Ⅳ precursor、Isoform3of NAD-dependent deacetylase sirtuin-2、Fibrinogen gamma chain precursor、Fibrinogen beta chain precursor、Plasma retinol-binding protein precursor、Alpha-1B-glycoprotein precursor、 Tether containing UBX domain for GLUT4和Transferrin等13种,表达下调的有Keratin, type Ⅰ cytoskeletal9、Serine palmitoyltransferase2、 Keratin, type Ⅱ cytoskeletal1、Serine/threonine-protein kinase MAK、 DNA damage-regulated autophagy modulator protein2、interleukin12A subunit alpha、Zinc-alpha-2-glycoprotein precursor等7种。随后,我们对鉴定的20种蛋白质进行了功能分析,结果发现这些蛋白涉及到机体的胰岛素抵抗、脂肪代谢、炎性相关、及细胞增殖、凋亡等生理过程,直接或间接影响了机体的卵泡发育和妊娠进程。(4) Western blot结果表明,Alpha-1-antitrypsin、Apolipoprotein A-Ⅰ和Transferrin三种蛋白质在PCOS患者卵泡液中表达均上调;RT-PCR结果表明,Serine/threonine-protein kinase MAK、DNA damage-regulated autophagy modulator protein2和Serine palmitoyltransferase2等三种蛋白质的mRNA在PCOS患者颗粒细胞中表达下调,提示了这三种卵泡液蛋白质来源于颗粒细胞的分泌,这些均与质谱鉴定的结果一致,而Apolipoprotein A-Ⅳ和(?)interleukin12A subunit alpha未见在颗粒细胞中有表达,提示其可能有其它来源。 以上实验结果表明,常规长方案COH后行IVF/ICSI-ET治疗的PCOS患者获得了与正常患者相同的妊娠率,但其流产率和OHSS发生率显著增加、而抱婴率显著降低,其作用机理可能与鉴定的20种卵泡液蛋白质的表达异常有关。这些蛋白质可能通过参与胰岛素抵抗、脂肪代谢、炎性相关、及细胞增殖、凋亡等生理过程直接或间接地影响卵子、胚胎的质量,及其子宫内膜的容受性等导致了PCOS患者IVF/ICSI-ET中较高的流产率和较低的抱婴率,对这些蛋白的进一步研究可为有效的促排卵助孕治疗服务。本研究为阐明PCOS的分子调控机制增添了新认识,并将为PCOS的诊断和治疗提供有价值的实验证据。


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