HGF及EGF体外诱导VEGF_(165)基因修饰BMSCs向肝细胞分化的研究

【摘要】：第一章骨髓间充质干细胞的培养、生物学鉴定及VEGF165质粒的扩增 目的：1.建立兔骨髓基质细胞(BMSCs)体外分离、培养、增殖、冻存的方法,以及探讨其生物学特性。2.VEGF165-pCMV6-AC-GFP质粒的扩增及鉴定。 方法：采用密度梯度离心法结合贴壁培养法分离纯化、扩增BMSCs,用流式细胞学及免疫细胞化学鉴定BMSCs,光学显微镜及扫描电镜观察BMSCs的细胞形态及生长特性,测定第1、3、5代BMSCs及10%、15%、25%FBS培养第3代BMSCs的生长曲线。BMSCs在10%DMSO条件下经液氮或-60。C冻存复苏,测其成活率及增殖能力。VEGF165-pCMV6-AC-GFP质粒转化大肠杆菌并扩增、抽提,检测浓度及纯度。 结果：BMSCs为贴壁生长,呈均一的梭形成纤维细胞样,流式细胞学显示BMSCs明显表达CD29(93.41%±3.2%,n=3)和CD44(91.55%±4.1%),而不表达CD45(3.95%±2.9%)和CD34(3.36%±3.6%),免疫细胞化学显示CD29和CD44表达阳性, CD45和CD34呈阴性。BMSCs生长曲线呈S型,1-3d为潜伏期,生长较慢；3d后进入对数生长期,步入快速增长；7-8d为平台期,细胞增殖速度趋于平缓。以15%FBS及第1代BMSCs生长状态最佳。BMSCs复苏后细胞活力达90%以上,其生长形态与冻存前无明显差异,可用于后续试验研究。提取的VEGF,65-pCMV6-AC-GFP质粒的纯度、浓度分别为1.83,0.75ug/ul,可应用于细胞转染试验研究。 结论：1.采用密度梯度离心法结合贴壁培养法分离纯化、扩增BMSCs可行。2.兔BMSCs增殖能力强,易体外分离、纯化、扩增,传代的BMSCs可保持其原有的生物学特性。3.冻存后复苏的BMSCs仍有较强的增殖能力。4.成功扩增高纯度的VEGF-pCMV6-AC-GFP质粒。 第二章构建VEGF165-pCMV6-AC-GFP基因修饰的BMSCs 目的：比较脂质体2000及电穿孔两种转染方法,为BMSCs基因转染提供可行方案,并建立最佳的转染条件。 方法：1.体外分离、扩增兔BMSCs,分别用脂质体2000、电穿孔转染第3代BMSCs,用显微镜观察细胞形态学变化及GFP荧光表达,绘制生长曲线观察细胞的增殖能力,用细胞流式法比较两种方法的转染效率。2.选择可行方案并优化转染参数,通过选择不同的电穿孔缓冲液(Opti-DMEM,含血清全培养基及D-Hanks液),选择不同的电压(250V,280V,310V),不同的质粒量(20ug,50ug,70ug)的条件下进行电转,用显微镜观察细胞形态学变化及GFP荧光表达,用细胞流式法比较两种方法的转染效率。3.以最优转染参数电转BMSCs后,用200ug/ml G418筛选电转后48h的BMSCs,用RT-PCR检测BMSCs电转后不同时间点VEGF165的表达情况。用单因素方差分析所得数据,以a=0.05为检验水准。结果：脂质体2000转染后BMSCs的GFP荧光数稀少,电穿孔转染的GFP荧光数较多,转染效率分别为5.12%、17.3%。脂质体2000转染后BMSCs生长曲线呈水平下降型,细胞几乎没有增殖,后期细胞逐渐死亡,电穿孔转染后BMSCs生长曲线仍呈S型。Opti-DMEM,含血清DMEM及D-Hanks液电穿孔转染效率分别是15.27%,10.53%,13.91%。250V,280V,310V电压电转后,台盼蓝测定细胞活力分别为75.6%,60.12%,42.59%。20ug,50ug,70ug质粒的电转效率分为14.10%、27.44%、40.57%。随着电压的增大及质粒量的增多,转染效率增高,细胞死亡数也同样增加。用200ug/mlG418筛选20天后转染效率达了0.46%。RT-PCR示：G418筛选20天后BMSCs的VEGF165基因表达明显增加(P0.05),去除筛选1W后VEGF基因水平稍降低,第2W和第3W后未见明显差异(P)0.05)。 结论：电穿孔法较脂质体2000更适用于BMSCs基因转染,并保存了BMSCs细胞形态及增殖能力。电穿孔转染最佳参数方案：2×106cells/ml,50ug质粒,电压280V,电容量1000Uf,电阻无穷大,脉冲一次。经200ug/ml G418筛选后可达到较高转染效率。 第三章VEGF基因对体外诱导兔BMSCs向肝细胞分化影响的实验研究 目的：探讨VEGF165-pCMV6-AC-GFP修饰的BMSCs在HGF和EGF诱导下体外向肝细胞分化的能力,研究VEGF165基因对BMSCs向肝细胞分化的影响。 方法：分离、培养兔BMSCs, VEGF165-pCMV6-AC-GFP质粒电转染第3代BMSCs,用G418筛选转染效率达70%,再分组如下：A组：HGF(60ng/ml)+EGF(45ng/ml)电转PCMV6-AC-GFP空载质粒,B组：HGF(60ng/ml)+EGF(45ng/ml)-电转VEGF165-pCMV6-AC-GFP质粒。于0、10、20天用光镜及扫描电镜观察BMSCs细胞形态及表面结构,用免疫细胞化学、细胞免疫荧光、Western-blot检测肝系细胞特异性标志：AFP和ALB,用实时-定量PCR检测ALB基因水平。用两因素方差分析所得数据,以a=0.05为检验水准。 结果：诱导14d后,BMSCs细胞呈短梭形和多角形。随诱导时间延长,多角形细胞增多,并可形成肝细胞样细胞集落。免疫细胞化学及免疫荧光示第10天：A组及B组的AFP表达阳性,A组ALB表达阴性,而B组的ALB表达阳性,第20天：A组及B组的AFP、ALB均为阳性。Western-blot示：B组的ALB表达水平较A组更早、更多(P0.05)；然而随着时间的延长,B组AFP表达水平下降,第20天时较A组明显减少(P0.05)。实时一定量PCR示第10天,两组均检测到了ALB基因,随诱导时间的延长,各组的ALB基因含量增加(P0.05),A组、B组的ALB基因含量在同一时间点没有显著性差异(P0.05) 结论：VEGF165-pCMV6-AC-GFP修饰的BMSCs在HGF、EGF诱导下可以向肝细胞分化,较对照组缩短分化时间,VEGF165有促进BMSCs在HGF、EGF诱导下可以向肝细胞分化的能力。这为基因细胞联合治疗肝脏疾病带来可靠依据。