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Smad2在氧糖剥夺再灌注损伤中的表达及其作用机制研究

贺文芳  
【摘要】:研究背景及目的: 转化生长因子TGF-β是一类普遍存在的细胞因子,在缺血性脑损伤中,TGF-β已被证实有神经保护作用。Smad家族是TGF-β受体的下游信号转导因子,不同Smad蛋白在神经系统疾病中发挥着不同的作用。Smad2作为TGF-β信号通路的始动效应分子,其在缺血性脑血管病中的作用机制尚不完全明了 钙离子是体内重要的信号分子,病理情况下如氧化应激时细胞内钙超载可以直接激活Caspase或其他激酶诱发凋亡。既往认为高尔基体在钙离子调节上作用较小,然而最新的研究结果表明,高尔基体同样在维持胞内钙稳态中有着重要作用。分泌途径衍生钙离子转运ATP酶(Secretory-pathway Ca2+-ATPase, SPCA)是P型ATP酶(P-type ATPases)的一类亚家族,目前已知SPCA的编码基因至少有两种:ATP2C1和ATP2C2,分别编码SPCA1和SPCA2,都定位于高尔基体且SPCA1表现出的活性更强。SPCA1泵控制着高尔基体内钙离子浓度,对高尔基体内及胞浆内钙离子浓度变化有着重要意义。SPCA1在脑组织中高表达并伴随着高活性。SPCA1在神经元的发育、迁移、形态发生中起着重要作用;神经系统发育过程中SPCA1持续性高表达的区域如海马、皮质、小脑恰好是对缺血最敏感的部位,以上均提示SPCA1在维持高尔基体功能和在神经系统疾病中的重要性。目前SPCA1的研究多局限在皮肤病,关于其在脑缺血性疾病中的作用研究很少。TGF-p可以通过下调胞内钙离子浓度达到保护细胞的作用,Smad2对于SPCA1的表达及功能是否有影响,国内外尚无研究。 死亡相关蛋白激酶(Death-as-sociating protein kinase, DAPK1)是一类钙离子/钙调素依赖激酶,目前认为DAPK1的主要生物学作用是参与细胞凋亡过程,在各种不同刺激下担任凋亡正向调节者的作用。 DAPK1与神经细胞的死亡密切相关,有研究表明低氧-缺血损伤动物模型中其活性升高,而DAPK1的抑制剂可以减轻缺血性脑损伤带来的打击,因此关于DAPK1在脑缺血再灌损伤中的作用正在成为目前的研究热点和药物靶点,但是国内的系统研究尚较少。Jang等发现TGF-β通过Smad2-4激活DAPK1的启动子而诱导其表达,进而促进细胞的凋亡。但是这一途径在神经细胞中是否立还未经证实。 本研究的目的旨在探索Smad2蛋白在脑缺血再灌损伤中的作用,是否与调节高尔基体钙泵SPCA1的功能和DAPK1相关,探讨Smad2可能的神经保护机制。 研究方法: 1.培养小鼠神经细胞瘤N2a细胞,建立氧糖剥夺再灌注模型,并采用MTT法、酶学检查、光学显微镜评价氧糖剥夺模型; 2.实验分为正常对照组、普通OGD/R组、药物干预后OGD/R组,其中普通OGD/R组、药物干预后OGD/R组按时间点不同分为1h、4h、6h三个亚组。干预药物为Smad2磷酸化抑制剂SB431542,特异性阻断Smad2活化。 3.流式细胞仪测定各组中细胞内钙离子浓度的变化以及凋亡率的变化。 4. Western blot检测各组中Smad2, p Smad2, SPCA1, DAPK1的蛋白表达变化。 5. QRT-PCR检测Smad2, SPCA1,DAPK1的基因表达水平变化。 6.酶学法测定各组中SPCA1活性的变化。 7.免疫荧光共聚焦方法观察SPCA1的细胞亚定位。 结果: 1.氧糖剥夺后细胞形态变化、LDH释放量、MTT检测显示:随着氧糖剥夺时间延长,小鼠N2a细胞形态结构发生显著变化,MTT吸光度值逐渐降低,培养液中LDH释放逐渐增加;氧糖剥夺/再灌注组均较同时间点氧糖剥夺组细胞形态变化明显,LDH释放量更大,MTT吸光度值更低(P0.05),表明再灌注过程进一步降低了细胞活性,加重了细胞损伤; 2.细胞内钙离子浓度的变化:在经历氧糖剥夺/再灌注后,各组细胞内游离钙离子浓度均较正常组明显升高(P0.05),说明OGD/R诱导了细胞内钙超载。钙超载的程度与OGD持续时间相关,4h时间点的钙离子浓度值为各时间点亚组中的最高值(P0.01)。相同氧糖剥夺/再灌注时间点,药物干预组的钙超载效应更明显(P0.05)。 3. SPCA1活性的变化:在氧糖剥夺再灌注后,细胞SPCA1的酶活性较正常组显著下降(P0.05),且下降程度与OGD持续时间相关。相同OGD时间点下,药物干预后的OGD/R组酶活性较未干预组更低(P0.05)。在普通OGD/R组,三个时间点之间OGD6h/R组的酶活性最低(P0.05);在药物干预后的OGD/R组,酶活性最低值出现在OGD4h/R组(P0.05)。经相关分析表明,钙离子浓度的变化与SPCA1酶活性的变化呈显著负相关(r=-0.722,P0.01)。 4.免疫荧光共聚焦结果:标记SPCA1的红色免疫荧光与标记GM130的绿色免疫荧光发生了明显重叠。说明SPCA1定位于高尔基体。 5. Smad2的蛋白和基因表达变化:经历OGD/R之后,各组的Smad2的蛋白和基因表达水平均高于正常组,且与OGD的持续时间相关,说明氧糖剥夺再灌注能上调Smad2的表达。在普通OGD/R组中,4h时间点Smad2的蛋白和基因表达水平为峰值(P0.05);磷酸化pSmad2的表达趋势与Smad2一致。在药物干预后,各时间点的Smad2蛋白表达均出现明显下降(P0.05),表明药物成功抑制了磷酸化pSmad2的表达,从而使总Smad2的蛋白水平下降;同时在基因水平也出现了有趣的变化,1h时间点Smad2的表达水平要高于普通OGD/R组,而4h及6h时间点Smad2的表达水平却低于普通OGD/R组,6h时间点的蛋白和基因表达水平为最低值(P0.05)。 6. SPCA1的蛋白和基因表达变化:氧糖剥夺再灌注之后,SPCA1的蛋白和mRNA水平较正常组明显下降(P0.05),与OGD持续时间呈相关性。在普通OGD/R组,1h和4h时间点的SPCA1蛋白呈持续低表达水平,6h时间点表达出现上调(P0.05);药物干预后的OGD/R组也出现了同样的趋势(P0.01)。mRNA的变化趋势与蛋白水平一致。我们进一步比较了同时间点下抑制Smad2的活性对于SPCA1表达的影响。我们发现,只有在6h时间点,两组出现了表达差异,药物干预组的SPCA1蛋白和基因表达水平较普通OGD/R组升高(P0.05)。 7. DAPK1的蛋白和基因表达变化:氧糖剥夺再灌注之后,DAPK1的蛋白和基因表达水平较正常组上调(P0.05);且与氧糖剥夺的持续时间相关。4h时间点的表达水平最高(P0.05)。药物阻断Smad2活化使DAPK1的表达进一步上调(P0.05)。 8.细胞凋亡率的变化:氧糖剥夺再灌注过程诱发了细胞的凋亡,与正常对照组有明显差异(P0.05);凋亡率与OGD的持续时间相关,4h组的凋亡率最高(P0.01)。药物干预使凋亡率较同时间点普通OGD/R组明显上升(P0.05),说明阻断Smad2的活化加重了细胞的凋亡损伤。 结论: 1. Smad2的表达水平受氧糖剥夺再灌注的调节。阻断Smad2的活化加重了细胞内钙超载的程度和凋亡率;Smad2有神经保护作用。 2.氧糖剥夺再灌注抑制SPCA1的功能活性,下调蛋白和基因表达水平。SPCA1功能受损参与导致了细胞内钙超载; 3. DAPK1的表达水平受氧糖剥夺再灌注的调节; 4. Smad2在氧糖剥夺再灌注中的作用与调节细胞内钙离子稳态密切相关。其机制可能与调节SPCA1的表达及功能、以及调节DAPK1的表达有关。


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