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线粒体氧化应激反应在大鼠慢性高眼压模型中的体现及锰超氧化物歧化酶基因的治疗作用

姜文敏  
【摘要】:目的: 观察慢性高眼压状态下,视网膜内氧化应激状态的改变对视网膜神经节细胞(retinal ganglion cell,RGC)损伤的程度,以及此状态下线粒体形态和功能蛋白的变化;以重组腺相关病毒介导的锰超氧化物歧化酶(Manganese superoxide dismutase, MnSOD)基因转染大鼠视网膜并建立慢性高眼压模型,探讨其对高眼压环境下的RGC的保护作用机制。 方法: 1.以联合光凝SD大鼠左眼的小梁网和上、下、颞侧巩膜浅表静脉,建立慢性高眼压模型,根据观察时间将高眼压大鼠(高眼压组)随机分为G1组、G2组、G3组、G6组,以右眼为自身对照眼(正常对照组);观察光凝后1月、2月、3月、6月大鼠组织病理改变,末端脱氧核酸转移酶介导的脱氧三磷酸尿苷缺口末端标记法(terminal TdT-mediated dUTP nick end labeling, TUNEL)法检测RGC凋亡情况,Brn3b抗体免疫荧光化学法特异性标记进行RGC并计数,观察高眼压状态下RGC存活情况; 2.检测视网膜组织匀浆中MnSOD、过氧化氢酶(catalase,CAT)活性及丙二醛(malondialdehyde bisdimethyl acetal,MDA)含量,Realtime-PCR法检测MnSOD、CATmRNA表达情况;Realtime-PCR. Western Blot法检测视网膜组织中Caspase-3mRNA及蛋白表达情况; 3.大鼠左眼玻璃体腔内注射PTR-UF11-MnSOD质粒,对视网膜行MnSOD基因转染,右眼注射空载质粒,21天后行左眼联合光凝建立慢性高眼压模型,根据观察时相将转染组分为IG1、IG2、IG3、IG6组,右眼为自身对照眼;运用Western Blot法对各转染组视网膜内MnSOD蛋白含量进行检测,以确定转染成功;观察造模后1月、2月、3月、6月转染组大鼠视网膜病理形态及超微结构改变,检测MDA含量,TUNEL法检测RGC凋亡情况,Brn3b抗体免疫荧光化学法进行视网膜神经节细胞计数;Realtime-PCR及Western Blot法检测方法检测治疗组视网膜中Caspase-3表达情况; 4.提取视网膜线粒体,并用Western Blot法检测高眼压组和转染组大鼠视网膜线粒体内视神经萎缩蛋白1(OPA1)、发动相关蛋白1(Drp-1)蛋白含量变化,Realtime-PCR检测高眼压组和转染组大鼠视网膜内OPA1、Drp-1mRNA含量。 结果: 1.慢性高眼压模型组大鼠视网膜神经节细胞层形态随造模月龄增加而逐渐变薄、空泡变性及核固缩增加,电镜观察线粒体肿胀、水肿、溶解,视神经纤维排列紊乱度增加,与间质组织分界欠清;Brn3b特异性标记RGC存活数目随观察月龄逐渐减少;随观察时相延长,TUNEL法检测视网膜细胞凋亡数量明显上升; 2.与正常对照组比较,高眼压组大鼠视网膜组织中MnSOD、CAT活性随观察时间延长均有下降趋势(p0.01),但其mRNA表达上调(p0.05);高眼压组视网膜内丙二醛含量随观察时相延长而增加(p0.01);高眼压组视网膜组织内caspase-3含量随观察时相延长而上调(p0.05);眼压恢复正常后,即观察时间6月,与正常组比较,RGC存活数仍在下降(p0.05), TUNEL法检测视网膜细胞凋亡阳性率仍在上升(p0.05), MnSOD、CAT活性仍在下降(p0.01),凋亡相关因子caspase-3表达仍下调(p0.05);随观察时相的延长,青光眼组大鼠视网膜线粒体内OPA1蛋白含量降低,而线粒体内Drp-1蛋白含量升高;视网膜内OPA1基因表达下调,Drp-1基因表达上调(p0.05); 3.相同观察时相,转染组视网膜病理结构改变较高眼压眼组轻微,Brn-3b特异性标记RGC存活率明显上升,TUNEL法检测视网膜细胞凋亡数明显降低;转染组大鼠视网膜内Caspase-3含量较正常组增加(p0.05),但较高眼压组明显降低;MnSOD基因转染后,视网膜内OPA1含量总体趋势上调,Drp-1含量总体趋势为下调,表明MnSOD促进线粒体的融合状态,而使线粒体分裂减少。但观察时相为6月时,OPA1无论是线粒体内蛋白含量,还是总体基因表达量,均有轻度降低。 结论: 1.成功建立慢性高眼压大鼠模型,并改进光凝间隔时间,观察并证实此种模型高眼压状态持续时间达到12周; 2.慢性高眼压状态下;视网膜内抗氧化防御体系功能降低;眼压恢复正常后,视网膜损伤仍在继续。 3.慢性高眼压状态下,抗氧化物酶SOD、CAT活性降低,但两者基因表达量升高,推测在氧化应激状态下,SOD、CAT蛋白翻译过程受阻; 4.从OPA1和Drp-1线粒体内蛋白含量和其视网膜内基因表达变化推测,氧化应激状态使OPA1从线粒体释放,而Drp-1由胞浆转入线粒体,从而使线粒体分裂增加,融合减少,细胞凋亡增加; 5.视网膜内MnSOD含量增加对于高眼压持续状态的RGC起到保护性作用,细胞凋亡减少;且MnSOD促进线粒体的融合状态,而使线粒体分裂减少。但其并不能完全消除氧化应激的损伤。


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