收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

甘草酸18H差向异构体及其水解产物对Ⅱ相解毒酶的影响及其机制的研究

谭亲友  
【摘要】:祖国医学很早就认识到甘草具有调和诸药和解毒的作用,认为甘草可以缓解其它药物的毒性和烈性。中药方剂中很多配伍甘草以缓其性。大量临床实践和实验研究均证明了甘草“解百药毒”这一传统认识的科学性。甘草酸(glycyrrhizic acid, GL)是甘草的主要活性成分,其钾、钙盐为甘草甜素(glycyrrhizin),水解后产生二分子葡萄糖醛酸和一分子甘草次酸(glycyrrhetinic acid, GA)由于其母核18位手性碳原子C-H键(18H)的构型不同,因此甘草酸存在两种差向异构体,即18a-甘草酸(18a-GL)和18p-甘草酸(18β-GL),两者水解之后可生成相应的18a-甘草次酸(18a-GA)和18p-甘草次酸(18β-GA)。由于在我国具有自主知识产权的异甘草酸镁“手性肝药”在2006年上市,甘草酸异构体的差异日渐受到国内外学者的关注。本课题组前期研究发现18β-GL能够诱导P-gp的表达,本文从Ⅱ相解毒酶的角度,研究了甘草提取物、甘草酸18H差向异构体及其水解产物对Ⅱ相解毒酶的影响及其机制的研究。目的 通过体内外实验研究甘草提取物及甘草酸18位差向异构体及其水解产物对UGT1A、UGT2B及其同工酶UGT1A1和UGT1A6和GSTπ的蛋白表达和转录水平mRNA的影响,探讨其对Ⅱ相解毒酶的作用是否具有立体选择性;拟初步证实甘草提取物及甘草酸18位差向异构体及其水解产物对Ⅱ相解毒酶诱导作用及其机制的研究;通过研究甘草酸制剂对对乙酰氨基酚药动学的影响,初步探讨甘草酸制剂与Ⅱ相解毒酶UGT底物在临床上可能发生的相互作用。 方法 1.甘草提取物和甘草酸18H差向异构体分别从不同浓度和不同时间对大鼠体内Ⅱ相解毒酶的影响 通过从不同浓度甘草提取物(90、180、360mg·kg-1)以及18α-GL和18β-GL(12.5、25、50mg·kg-1)和不同时间(3、6、12天)对大鼠进行灌胃诱导实验,用芯片阵列免疫组化技术手段实验考察试验药物对Ⅱ相解毒酶UGT1A和UGT2B及GSTπ的影响。2.甘草提取物、甘草酸18H差向异构体及其水解产物在大鼠体内对Ⅱ相代谢解毒 酶的影响 42只大鼠随机分为空白组(生理盐水)、甘草提取物(14.3%甘草酸)组、18a-GL、18β-GL、18α-GA、18β-GA、阳性对照组(苯巴比妥),每组6只,分别诱导7天。于第八天处死,采用肝灌流方法取出肝脏组织,通过肝微粒体法、western blot法和阵列组织芯片免疫组化法等“三位一体”的实验方法,从肝组织的亚细胞水平和组织形态学水平考察甘草提取物及其主要成分18α、β-GL和18α、β-GA对UGT1A、UGT1A1、UGT1A6和UGT2B及GSTπ的影响。 3. HepG2细胞培养及MTT毒性实验采用DMEM培养基常规培养HepG2细胞,用于研究甘草提取物、甘草酸18位差向异构体及其水解产物对Ⅱ相解毒酶UGT和GST的影响。采用苯基溴化四氮唑蓝法(MTT),判断各试验药物的体外最大非细胞毒性剂量,保证试验过程中细胞的活性,并为甘草提取物、18α、p-GL和18α、p-GA对UGT1A、UGT2B、UGT1A1、UGT1A6和GSTπ以及转染实验的研究提供与细胞作用的最大浓度。 4.甘草提取物和甘草酸18位差向异构体及水解产物在HepG2细胞中对Ⅱ相解毒酶蛋白表达和转录的影响 以利福平作为阳性对照,不加药处理的HepG2细胞作为阴性对照,通过Western-Blot和Q-PCR法从蛋白的表达水平和mRNA转录水平来研究甘草提取物及其主要成分甘草酸和甘草次酸差向异构体对Ⅱ相酶UGT1A,UGT2B及同工酶UGT1A1和UGT1A6及GSTπ的影响。 5.甘草提取物、甘草酸18H差向异构体及其水解产物通过核受体PXR及CAR对UGT1A1和UGT1A6转录活性的影响构建hPXR、hCAR和RXRa真核表达质粒及UGT1A1和UGT1A6荧光素酶报告基因质粒,瞬时共转染外于肝癌HepG2细胞中,DMSO作为空白对照组,利福平作为PXR阳性对照组,PCN作为是PXR阴性对照组,CITCO作为CAR阳性对照组,TCPOBOP作为CAR阴性对照组。药物处理组:甘草提取物(2、20、200mg·mL-1),18α-GL,18β-GL、18α-GA、18β-GA四个差向异构体低、中、高三个浓度为(1、10、100μM)。用荧光素报告基因法检测甘草提取物及其主要成分18α、β-GL和18α、β-GA对报告基因转录活性的影响。 6.甘草酸制剂对对乙酰氨基酚药动学的影响 采用随机开放,三周期交叉自身对照的拉丁方设计,12名受试者随机等分为3组,分别为甘草酸二胺胶囊组,即试验组;葡醛内酯组,即对照组;以及安慰剂组。洗脱期为2周。受试者于服药前(空白)和服药后0.16、0.33、0.5、0.75、1.0、1.5、2、3、4、6、8、10、12和24小时点前臂静脉血4mL。分离血浆,立即置-70℃冰箱中保存,并在规定的时间内及时进行测定。尿样收集于给药前及给药后0-2,2-4,4-6,6-8,8-12,12-24h各时段尿液收集于一容器中,记录总量并留取标本,于-70℃保存备用。采用HPLC-MS/MS法测定血浆中对乙酰氨基酚及其结合物的浓度。使用DAS2.1.1软件计算药动学参数,SPSS17.0软件进行统计分析。 结果与结论 1.肝组织的芯片阵列免疫组化实验结果经统计学分析,发现甘草提取物及18α-GL和18β-GL对Ⅱ相解毒酶UGT1A和UGT2B诱导作用成剂量依赖性和时间依赖性,对谷胱甘肽转移酶GSTπ也有诱导作用,但时间依赖性和剂量依赖性不明显。 2研究结果表明,大鼠经实验药物诱导七天后,甘草提取物对UGT1A、 UGT1A1、UGT1A6、UGT2B有明显的诱导作用。对GSTπ有诱导作用,但作用不明显。发现甘草的主要成分18α-GL和18β-GL对UGT及其部分同工酶UGT1A1、UGT1A6有诱导作用,其中18β-GL对Ⅱ相酶的诱导作用表现更加明显。18α-GA对UGT2B有明显的诱导作用,与18α-GA相比,18β-GA对UGT1A及其部分同工酶UGT1A1和UGT1A6的诱导作用更加明显。甘草酸和甘草次酸以及其差向异构体的在很多相互比较的研究中都有一定的差异,两者在代谢方面的区别应受到重视。 3.甘草提取物在HepG2细胞中对UGT1A、UGT2B、UGT1A1、UGT1A6和GSTπ蛋白表达和转录水平mRNA的表达有明显的增强作用,18α、β-GL对UGT1A、UGT2B、UGT1A1、UGT1A6和GSTπ蛋白表达和]mRNA的表达有增强作用,其中18β-GL对UGT1A1和UGT1A6蛋白表达和转录水平有显著的增强作用,这点与大鼠肝组织中报道的18β-GL较18α-GL对Ⅱ相酶诱导作用更明显较为一致;18α-GA和18β-GA在细胞水平对UGT1A、UGT2B、UGT1A1、UGT1A6和GSTπ蛋白表达和nRNA表达比在大鼠肝组织中更加明显,尤其18β-GA在转录水平对UGT1A、UGT1A1、UGT1A6、UGT2B和GSTπ的mRNA表达量都具有明显的增加作用,在蛋白表达水平对UGT1A、UGT1A1也有明显增强作用。18β-GL和18β-GA对Ⅱ相酶的诱导作用可能具有同向性。 4.甘草提取物、18α、β-GL和18α、β-GA通过核受体CAR或PXR对UGT1A1和UGT1A6转录活性产生影响,在高剂量时这种影响更加明显。另外18α、β-GL对这种转录活性的影响有一定的差异性,尤其是18α-GL除了高剂量有较强的作用外,低、中剂量通过核受体CAR或PXR对UGT1A1和UGT1A6转录活性产生影响不是很明显,然而18β-GL低、中、高剂量通过核受体CAR或PXR对UGT1A1和UGT1A6转录活性的影响均有显著的增强作用。这也从作用机制方面解释了本课题前面研究报道的18β-GL对Ⅱ相解毒酶UGT有显著诱导作用真正原因。18α、β甘草次酸也通过核受体CAR或PXR对UGT1A1和UGT1A6转录活性产生影响,但仅在高剂量时这种作用较为明显。总之,甘草提取物、18α、β-GL和18α、β-GA通过诱导核受体CAR或PXR,从而进一步诱导下游UGT1A1和UGT1A6等一系列解毒靶基因的表达,这可能是甘草解百毒的重要作用机制之一,下一步可以从PXR/CAR介导解毒酶与外排泵的联合作用机制(如P-gp-UGT或MRP-UGT共转运体系)进行研究,以探明甘草解百毒真正联合机理。 5.对乙酰氨基酚药动学实验表明,对乙酰氨基酚的药动学参数(AUCo-24,AUCo-∞,Cmax)在试验组和安慰组之间有较大差异,且AUC0-∞有统计学意义(P0.05),同时也观察到对乙酰氨基酚的总体消除半衰期有所加快。在我们也比较对乙酰氨基酚葡萄糖醛酸结合物(PG)血药浓度在三个实验组中的变化,发现甘草酸二胺胶囊组中的PG主要药动学参数与安慰组相比有显著变化,尤其是AUCo-24,AUCo-∞都有统计学意义(P0.05)。与安慰组相比,葡醛内酯试验组在整个过程中对对乙酰氨基酚及其结合物的主要药动学参数有所影响,但变化不大。据此我们推测甘草酸二胺胶囊组可能诱导Ⅱ相酶UGT,从而加快底物对乙酰氨基酚的代谢,使结合物的生成增加,进而促进排泄。葡醛内酯组结果显示,增加葡萄糖醛酸能在一定程度加快UGT底物的代谢和排泄,但起主要作用的可能还是由于诱导了Ⅱ相结合酶UGT所致。本试验中也有些APAP和PG主要药动学参数变化不明显,可能是我们诱导时间太短,也有可能是受试者体内影响底物对乙酰氨基酚代谢UGT同工酶的UGT1A6、UGT1A1和UGT1A9的多态性从而对有些药动学参数产生了影响,因此下步实验可以从扩大样本量,基因分型等角度来进一步研究甘草酸制剂对Ⅱ相解毒酶的诱导作用。 本研究对甘草提取物、甘草酸18位差向异构体及其水解产物对UGT和GST的影响进行了探讨,在体内外实验中发现实验药物不同程度地对UGT1A,UGT2B及部分同工酶UGT1A1、UGT1A6, GSTπ有诱导作用;其中甘草提取物和18β-GL对Ⅱ相解毒酶的有显著诱导作用,验证了实验药物通过上调上游因子PXR和CAR信号通路从而增加下游UGT1A1和UGT1A6等一系列解毒基因的表达,可能这个信号通路是甘草解毒的重要机理之一,在比较差向异构体对Ⅱ相结合酶UGT和GST的作用是否存在立体选择性发现由于它们之间存在一定的差异,但没有显著的影响。本实验为临床上甘草应用于解毒治疗提供新的理论支持,也为其它具有解毒作用的中药研究提供新的思路,同时为临床药物相互作用研究提供科学的理论依据.


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 刘淑卿,朱大元,高清勇,蒋福祥;双炔失碳酯差向异构体的分离和定量分析[J];生殖与避孕;1987年03期
2 谢蓝,池华,周同惠;山莨菪碱(654-2)异构体的高效液相色谱法分离[J];药学学报;1991年07期
3 杨德英;改进的HPLC法测定固体制剂中的红霉素[J];国外医学.药学分册;1988年04期
4 熊雯;张丹;;对USP与BP替卡西林HPLC方法分离替卡西林差向异构体的比较[J];中国抗生素杂志;2010年02期
5 张劲强;梁岩;董元华;黄铭洪;;差向异构对四环素类药物的发光菌毒性研究[J];毒理学杂志;2006年05期
6 颜苗;李兰芳;李焕德;;甘草酸、甘草次酸18位差向异构体比较研究的进展[J];中药新药与临床药理;2010年05期
7 王佩;刘晓昱;吴锡铭;;反相高效液相色谱法测定甘草酸18H-差向异构体含量[J];中国药业;2008年19期
8 赵静;赵璇;贾娴;徐秀玲;游松;;布地奈德差向异构体核磁共振的研究[J];沈阳药科大学学报;2009年01期
9 唐维媛;张义明;董永刚;;HPLC法同时测定野木瓜中齐墩果酸与熊果酸的研究[J];中国食品添加剂;2010年04期
10 王仲山,曹秀玲;二氢青蒿素的变旋作用与差向异构体转化研究[J];药学学报;1988年08期
11 杨大军,张瑞;四环素类抗生素的RP-HPLC分析[J];药学学报;1992年07期
12 徐芳,李芳,廖清江;13α-去氢表雄酮的皮质甾类侧链及其13β-差向异构体的合成[J];中国药科大学学报;1994年02期
13 刘宁,杨腊虎,张正行,俞如英;双氢青蒿素差向异构体转化的研究[J];药物分析杂志;2002年04期
14 汪现,翁玲玲,张祖兵;17-α雌二醇3-醚化合物的合成及初步生理活性研究[J];华西药学杂志;2003年01期
15 侯卫南;王健;聂晓明;杨腊虎;;N-乙酰-D-葡萄糖胺差向异构体及有关物质的HPLC研究[J];药物分析杂志;2008年07期
16 倪坤仪;;熊去氧胆酸和鹅去氧胆酸差向异构体的核磁共振谱和液相色谱[J];药学进展;1986年03期
17 高莹莹;;人参皂苷Rg_3差向异构体对猪冠状动脉收缩的立体定向作用[J];国外医药(植物药分册);2007年01期
18 邓瑜林;朱志真;辛艳茹;;灰毛茄中的薯芋皂甙元与雅姆皂甙元[J];国外医学.药学分册;1979年01期
19 梁光义;;刺梨甙及野薔薇甙的分离和结构研究[J];Journal of Integrative Plant Biology;1988年04期
20 李丽萍;蒋惠娣;吴好好;陈婷;;菊花黄酮及其水解产物效应成分在家兔体内动力学研究[J];中国药学杂志;2005年24期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 秦彩玲;刘婷;张毅;谭余庆;霍海如;周敏;尉萍萍;姜廷良;;参麦注射液抗大鼠内毒素休克药效学和药动学探讨[A];2000中药研究论文集[C];2001年
2 曹兰秀;周永学;;从中药配伍的特殊性谈中药复方药动学的研究思路[A];中华中医药学会方剂学分会2007年年会论文集[C];2007年
3 肖学凤;高岚;莫凡;刘昌孝;;黄连解毒汤中盐酸小檗碱在大鼠体内的药动学研究[A];第九届全国药物和化学异物代谢学术会议论文集[C];2009年
4 孙永学;严楚;曾东平;刘雅红;;沃尼妙林在猪体内的药动学及残留消除规律研究[A];中国畜牧兽医学会兽医药理毒理学分会第十次研讨会论文摘要集[C];2009年
5 刘利锋;赵杰;江善祥;;UV-HPLC法测定国产头孢喹肟在猪体内的药动学与残留[A];中国畜牧兽医学会兽医药理毒理学分会第十次研讨会论文摘要集[C];2009年
6 李文钧;彭小英;马张英;郑永兴;;口服抗肿瘤药赛特铂在大鼠的药动学[A];浙江省医学科学院建院55周年院庆论文专辑[C];2005年
7 彭文兴;李焕德;王峰;苏芬丽;;罗红霉素与氨溴索体内相互作用研究[A];2008年中国药学会学术年会暨第八届中国药师周论文集[C];2008年
8 唐文富;龚翰林;任艳怡;万美华;黄熙;;口服大承气汤在大鼠药动学的时间节律[A];2009全国时间生物医学学术会议论文集[C];2009年
9 张玲玲;赵杰;莫菲;金前跃;江善祥;;2种剂型麻保沙星在健康家犬的药动学比较[A];中国畜牧兽医学会兽医药理毒理学分会第十次研讨会论文摘要集[C];2009年
10 范云;林能明;方罗;罗吕宏;黄志煜;余海峰;;乙二醇脂质体多柔比星为主的联合方案治疗外周T细胞性淋巴瘤的药动学和药效学研究[A];第十一届中国抗癌协会全国淋巴瘤学术大会教育论文集[C];2009年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 谭亲友;甘草酸18H差向异构体及其水解产物对Ⅱ相解毒酶的影响及其机制的研究[D];中南大学;2012年
2 颜苗;甘草酸18位差向异构体及其水解产物对P-糖蛋白影响的研究[D];中南大学;2010年
3 陈虹;抗癌有效成分哥纳香醇甲类似物的合成和构效关系研究[D];中国协和医科大学;1999年
4 郑国钧;黄皮酰胺衍生物及立体异构体等的合成研究[D];中国协和医科大学;1998年
5 王光星;黄毛耳草碱全合成研究[D];中国协和医科大学;1998年
6 陈瑛;两种番荔枝科植物东京紫玉盘和长叶哥纳香中抗肿瘤化学成分研究[D];中国协和医科大学;1997年
7 蒋忠;番荔枝科植物田方骨抗肿瘤化学成分研究[D];中国协和医科大学;1997年
8 李行舟;黄皮酰胺代谢产物及衍生物的合成研究[D];中国协和医科大学;2002年
9 王晓波;复方黄黛片药动学和诱导肿瘤细胞凋亡机制的研究[D];沈阳药科大学;2007年
10 黄龙江;金银花抗病毒有效成分双抗素类似物的合成研究[D];中国协和医科大学;2006年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 易丹;大豆异黄酮对健康人体内华法林药动学和药效学的影响[D];中南大学;2007年
2 黄洁;甘草对乌头解毒作用的实验研究[D];湖南中医药大学;2007年
3 陈学宏;中药大黄在草鱼体内的药动学研究[D];四川农业大学;2006年
4 张新萍;头孢地尼分散片健康人体药动学和相对生物利用度研究[D];郑州大学;2006年
5 杨瑞;紫杉醇长循环热敏脂质体的研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2008年
6 龚倩;以药动学的观点评价复方头孢克洛分散片的组方合理性[D];中南大学;2007年
7 甘发平;丹参酮ⅡA的药动学研究及透过血脑屏障的初步考察[D];浙江大学;2008年
8 黄小玉;盐酸乐卡地平片人体药动学和生物等效性研究[D];重庆医科大学;2009年
9 程钢;米屈肼胶囊的人体药物动力学及其对人血浆中左卡尼汀浓度的影响[D];中南大学;2009年
10 张焕明;A.硝酸酯在17α-乙炔雌二醇17位差向异构化中的应用B.17,17-或17,20-二活泼氢雌二醇衍生物的分子设计与合成研究[D];四川大学;2004年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 董智;小分子药聚乙二醇化的利与弊[N];中国医药报;2008年
2 湖南省兽药饲料监察所 肖安东 研究员;优质兽药必备的因素[N];中国畜牧兽医报;2006年
3 吴一福;注重生物等效性的研究[N];中国医药报;2004年
4 张文;热分析技术在药物分析中的应用[N];中国医药报;2002年
5 沈群 罗佳波;重视中药复方药动学研究的特殊性[N];中国医药报;2005年
6 山东省滨州市中心医院 赵民生 曹秀虹;医院药学的职能转变[N];医药经济报;2006年
7 张骁;束梅英;偏头痛治疗药物研究进展[N];中国医药报;2003年
8 ;高效混凝沉淀净水技术简介[N];中国建设报;2004年
9 本报记者  白毅;青年英才显锋芒[N];中国医药报;2006年
10 张东方;沙明;杨松松;人工神经网络在中药领域中的应用[N];中国医药报;2003年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978