虎纹捕鸟蛛Kunitz型毒素基因的分子改造和表达

【摘要】：研究背景 虎纹捕鸟蛛是我国特有的大型有毒蜘蛛。HWTX-XI(虎纹捕鸟蛛毒素-Ⅺ)是从虎纹捕鸟蛛粗毒中提取的一种Kunitz型多肽毒素,具有很强的胰蛋白酶抑制作用,研究表明可用于治疗急性胰腺炎,但它同时具有阻断钾离子通道的作用,在动物身上表现出较弱的神经毒性。其胰蛋白酶抑制活性和钾离子通道阻断活性的功能区域相互独立,非常有利于毒素改造。HW11c40是从虎纹捕鸟蛛毒腺中克隆到的一种新型基因,它所编码的Kunitz型多肽毒素和HWTX-XI具有相似的空间结构以及胰蛋白酶抑制关键活性残基K14,但其不具有钾离子通道抑制的关键活性残基R25。推测,HW11c40和HWTX-XI一样具有强大的胰蛋白酶抑制活性,而其钾离子通道阻断活性会更低。有希望通过对HW11c40进行基因改造,消除其钾离子通道阻断活性,研制出治疗急性胰腺炎的高效药物。然而从天然毒液中分离的蜘蛛毒素远远不能满足研究和开发的需要,蜘蛛毒素的获取一直是限制其研究的难题。目前,通过基因工程表达蜘蛛毒素是一种有效的人工获取毒素的方法。 研究目的 1、探索出适合HWTX-XI表达的表达系统,解决HWTX-XI研究来源问题。 2、对HW11c40进行分子改造,以期消除神经毒副作用,提高多肽稳定性,获得专一高效的胰蛋白酶抑制剂。找到适合HW11c40突变体表达的表达系统,为筛选出合适的突变体进而研制出高效的治疗急性胰腺炎及其胰蛋白酶相关性药物奠定基础。 研究方法 1、PCR克隆出HWTX-XI的片段重组到载体pET-40b(+)中,构建出重组载体,将重组载体转入至大肠杆菌BL21(DE3)进行周质表达,获得HWTX-XI的融合蛋白,通过肠激酶酶切融合蛋白释放出HWTX-XI的目的蛋白、再经镍柱和色谱进一步分离纯化、最终用质谱鉴定。并对表达的条件进行了优化。 2、通过PCR定点突变法对HW11c40进行分子改造后,分别转入载体pVT102U/a和pET40b(+)中,构建出其四个突变体[Y35C]、[Y35CD39N]、[RLY56(35) LEC]及[RLY56(10)(35) LETC]的重组载体,再分别通过酿酒酵母S78真核表达系统和大肠杆菌BL21(DE3)原核周质表达系统中进行表达,接着进行分离纯化,最终用质谱鉴定。 研究结果 1、原核周质表达系统表达出了HWTX-XI融合蛋白,经肠激酶酶切成功释放出目的蛋白,再经质谱鉴定验证其表达成功,样品冻干后最高量达3.4mg/L。HWTX-XI最优表达条件是无IPTG诱导,30度,培养15-20小时。 2、对HW11c40进行了成功的突变,并构建出相应的突变体重组载体。酿酒酵母S78真核表达系统只表达出HW11c40的一种突变体[Y35CD39N](HW11c40M2)。BL21(DE3)原核周质表达系统表达出了所有的突变体的融合蛋白,经肠激酶酶切后,Trince SDS PAGE鉴定证实都获得了对应的目的蛋白。其中[Y35C](KpnIHW11c40M1)又经进一步的分离纯化和质谱鉴定,验证其获得表达。 研究结论 1、首次用该原核周质表达系统高效表达出HWTX-XI,并对表达条件进行了优化,探索出HWTX-XI表达的新途径。 2、对HW11c40成功的进行了分子改造,并用原核周质表达系统表达出了以增强多肽稳定性,降低钾离子通道阻断活性,提高胰蛋白酶抑制活性为目的HW11c40的4种突变体多肽毒素,证实此原核周质表达是适合的表达系统。为后期活性研究,筛选出有意义的突变体,继而研制高效治疗急性胰腺炎药物奠定基础。