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高效耐酸耐热木聚糖酶及木聚糖酶/甘露聚糖酶双功酶的构建

郭宁  
【摘要】:木聚糖酶和甘露聚糖酶作为半纤维素酶类,被广泛的应用于食品、饲料、造纸、纺织和医药等领域。 本研究对来源于Aspergillus niger的两种木聚糖酶基因进行基因序列优化、拼接合成及表达,研究了重组木聚糖酶的酶学性质,优化了重组木聚糖酶基因工程菌的培养条件,并在此基础上构建木聚糖酶-甘露聚糖酶/甘露聚糖酶-木聚糖酶双功酶,考察了双功酶的酶学性质以及连接肽对酶学性质的影响。主要内容包括以下方面: 1.重组木聚糖酶的构建及发酵条件的优化 本研究对两条木聚糖酶进行了密码子序列和mRNA稳定性的优化,将优化后的基因分割成相互重叠的短寡核苷酸片段,通过DA-PCR和OE-PCR拼接出全长的基因并在毕赤酵母中实现了表达。 纯化后的重组Xyn10和Xyn11的SDS-PAGE电泳显示的条带分别位于33kDa和20kDa,与理论大小一致,且比酶活大小分别为2504U/mg和22253U/mg。重组Xyn10最适温度和pH分别为60℃和5.0,经80-90℃和pH2.2处理后酶活几乎完全丧失。重组Xyn11最适温度和pH为50℃和5.0,该重组酶在pH1.0-12.0下处理2h仍然具有71%以上的酶活力,在90℃处理10min仍有40%的酶活。两种重组酶都对桦木木聚糖的亲和力最大,而对山毛榉木聚糖的催化效率最高,其中重组Xyn11对山毛榉木聚糖的催化效率达到3401.08mL/mg/s。 本研究从400株Xyn11重组子中筛选获得一株高表达且遗传稳定的重组菌株Ax11-151,通过单因子和响应面优化后,摇瓶发酵48h的重组Xyn11产量达到2883.86U/mL,是优化前的2.51倍。 2.木聚糖酶-甘露聚糖酶和甘露聚糖酶-木聚糖酶融合酶的构建 选取性质较好的木聚糖酶基因xyn11和甘露聚糖酶基因man26作为亲本,采用木聚糖酶-甘露聚糖酶和甘露聚糖酶-木聚糖酶两种连接顺序以及(GGGGS)n和(EAAAK)n(2≤n≤4)作为连接肽,通过酶连法和重叠延伸拼接法构建了15种正确连接的融合酶基因以及3种突变基因,15种融合基因在毕赤酵母中都得以成功表达并表现出双功能酶活性。重组融合酶存在高度糖基化现象,经去糖基化酶Endo H处理后重组融合酶呈现的条带与理论值57-58kDa一致。 15种融合酶的作用温度和作用pH性质与亲本差异不大。但连接肽为(EAAAK)n(2≤n≤4)的双功酶的热稳定性和酸稳定性均高于连接肽为(GGGGS)n(2≤n≤4)的双功酶。双功酶对底物燕麦木聚糖的亲和力和催化效率(kcat/Km)仅为亲本Xyn11的21%-42%,而融合酶对底物刺槐豆角催化效率则高于亲本Man26。连接肽为3个重复的(GGGGS)/(EAAAK)的双功酶对两种底物的催化效率高于2个和4个重复的(GGGGS)/(EAAAK)的双功酶。 N端为木聚糖酶序列的融合双功酶XE3M和XS3M降解丝瓜络的协同效率明显高于N端为甘露聚糖酶的融合双功酶ME3X和MS3X;融合双功酶对70-200目的丝瓜络降解的协同效率最高,XE3M的协同效率最高可达到1.57。 综上所述,重组木聚糖酶Xyn11具有较高的发酵酶活和催化效率、较宽的作用温度和pH范围,以及较好的耐热性和耐酸性。在食品、饲料和医药方面具有较好的应用前景。另外,本研究为木聚糖酶-甘露聚糖酶和甘露聚糖酶-木聚糖酶双功酶的构建和连接肽的选择奠定了一定的基础。


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