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川芎嗪对大鼠急性脊髓损伤中miRNA-24和Bim蛋白表达的影响

王冠  
【摘要】:第一章绪论 急性脊髓损伤(acute spinal cord injury, ASCI)是一类由外伤所引起的具有高致残性的中枢神经创伤,近年来其发病率一直居高不下。脊髓损伤可以分为原发性损伤和继发性损伤两大类。目前国际上的研究重点都放在如何减少继发性损伤,促进脊髓功能的恢复。miRNA是广泛存在于生物体内的小分子RNA,在生命活动中具有广泛的调节作用。有研究发现具有抑制细胞凋亡作用的miRNA-24参与了急性脊髓损伤的病理过程。本课题组也在前期的研究中发现miRNA-24的表达在SCI后明显改变,但其在SCI中的具体作用和机制并不明确。川芎嗪(Tetramethylpyrazine, TMP)化学名为四甲基吡嗪,是一种从川芎中发现的生物活性单体,在治疗心血管疾病方面具有确切的作用。近年来关于川芎嗪的研究发现它在急性脊髓损伤后具有保护脊髓功能的作用,其在SCI中的作用机制还需要进一步研究。为此,本研究以大鼠急性脊髓损伤模型为基础,结合分子生物学技术检测miRNA-24、Bim蛋白的表达以及细胞凋亡的情况,探讨大鼠SCI中miRNA-24、Bim和细胞凋亡的关系,分析TMP对miRNA-24和Bim的影响,为SCI的临床治疗提供科学理论依据。 第二章SCI中miRNA-24、Bim和细胞凋亡的关系 目的 通过检测SCI后miRNA-24、Bim的表达已经细胞凋亡的情况,分析大鼠急性脊髓损伤中miRNA-24、Bim和细胞凋亡的关系。 方法 选用48只成年雄性SD大鼠,分为正常对照组(n=12只)和脊髓损伤组(n=36只)。正常对照组仅进行椎板切除,脊髓损伤组按照ALLEN'S WD打击法建立大鼠急性脊髓损伤模型,并按时间点分为1、3、7天三个亚组,每组12只。按时间点处死大鼠,提取大鼠脊髓损伤段,分别利用real-time PCR、免疫组织化学、Tunel法等分子生物学技术,检测SCI后miRNA-24、Bim的表达以及细胞凋亡的情况,验证它们在SCI后大鼠脊髓组织中的变化。采用SPSS17.0软件对数据进行分析,对三个指标两两之间进行相关性研究,分析miRNA-24表达变化与Bim、细胞凋亡之间的关系。 结果 (1)大鼠SCI后,脊髓组织中miRNA-24的荧光阈值循环数(Ct值)明显升高,在第3天达到峰值,随后逐渐下降;与正常对照组相比,脊髓损伤组第1、3、7天的miRNA-24Ct值均具有统计学差异(P0.05)。miRNA-24的Ct值与细胞凋亡情况之间存在显著的正相关关系,相关性系数r=0.962,P0.01,即]miRNA-24的表达与细胞凋亡存在负相关关系。 (2)Bim的平均灰度值在大鼠SCI后明显降低,随后逐渐增高;正常对照组和脊髓损伤组第1、3、7天具有明显差异(P0.01)。Bim的平均灰度值与细胞凋亡负相关(r=-0.815,P0.01),即Bim的表达与细胞凋亡存在正相关关系。 (3)miRNA-24的Ct值与Bim平均灰度值的相关系数r=-0.809,P0.01,表明miRNA-24的表达与Bim的表达呈明显负相关。 结论 (1) miRNA-24和Bim可能参与大鼠急性脊髓损伤后的细胞凋亡过程; (2) miRNA-24与Bim的表达存在负相关关系,Bim可能是miRNA-24参与大鼠SCI后细胞凋亡过程的重要环节。 第三章川芎嗪对miRNA-24和Bim蛋白表达的影响 目的 通过对比生理盐水治疗组和川芎嗪治疗组中各个指标,分析TMP对miRNA-24和Bim蛋白表达的影响,验证TMP在脊髓损伤中的作用,并探讨其可能的作用机制。 方法 选用成年雄性SD大鼠72只,随机分为两组,制作大鼠脊髓损伤模型后,TMP组使用2%盐酸川芎嗪注射液200mg/kg进行腹腔注射,每天一次,持续5天;NS组使用等量等频率的生理盐水作对照治疗。按时间点1、3、7天提取标本后,利用real-time PCR、免疫组织化学、Tunel法等技术检测两组大鼠脊髓组织中miRNA-24、Bim的表达以及细胞凋亡的情况,利用t检验分析对应时间点两组大鼠的这些指标是否具有差异性,验证TMP在SCI中的作用,研究TMP对SCI后miRNA-24和Bim表达的影响,探讨TMP可能的作用机制。 结果 (1)TMP组miRNA-24的Ct值在SCI后的第7天较NS组有明显的降低(P0.05),第1、3天无明显差异。 (2)TMP组Bim的平均灰度值在第7天与NS组Bim的平均灰度值相比有明显的升高(P0.05)。 (3)TMP组的细胞凋亡指数在第3、7天较NS的细胞凋亡指数有较为明显的下降(P0.05),即TMP在SCI后能够抑制细胞凋亡。 结论 (1)川芎嗪能够减轻SCI后损伤段脊髓组织中的细胞凋亡; (2)川芎嗪能够上调大鼠脊髓损伤后脊髓组织中miRNA-24的表达,同时下调Bim蛋白的表达,这可能是川芎嗪抑制细胞凋亡的机制之一。


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