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miR-141在膀胱尿路上皮癌中的表达及其功能研究

王军  
【摘要】:第一部分miR-141在膀胱尿路上皮癌组织及膀胱癌细胞株中的表达 目的研究膀胱尿路上皮癌组织及相关细胞株miR-141及EMT相关蛋白的表达情况。 方法采用实时荧光定量PCR检测20例膀胱尿路上皮癌及不同膀胱尿路上皮癌细胞株miR-141的表达水平,分析其与膀胱尿路上皮癌临床参数的关系;采用Werstern-blot技术检测膀胱尿路上皮癌组织、淋巴结转移灶及相关细胞株EMT相关蛋白的表达情况,评估其EMT状态,并分析不同EMT状态组织及细胞株miR-141的表达情况。 结果同正常尿路上皮粘膜及癌旁组织相比,miR-141在尿路上皮癌组织中的表达显著上调;同表浅性膀胱癌相比,miR-141在肌层浸润性膀胱癌中的表达则显著下调;同EMT程度较轻肿的瘤原发灶相比,miR-141在EMT程度较强的淋巴结转移灶中的表达显著下调;相对于EMT程度较轻的HTB9及T24细胞株,miR-141在EMT程度较强的UMUC3细胞株中表达水平显著下调。 结论随肿瘤分期及分级的提高,miR-141表达水平逐渐降低;无论是膀胱尿路上皮癌组织还是细胞株,随EMT程度的增加,miR-141的表达水平均逐渐降低;在尿路上皮癌进展过程中,miR-141及EMT相关蛋白可能都具有重要作用。 第二部分pri-mir-141慢病毒载体的构建及稳定转染膀胱癌UMUC3细胞株 目的构建miR-141过表达膀胱癌细胞株,为进一步的体外细胞研究提供基础。 方法将根据miRBase数据库数据合成的pri-mir-141序列克隆至pLVX-IRES-ZsGreen1构建pYr-LVX-pri-mir141表达质粒,并行质粒酶切鉴定及测序;将构建的miR-141过表达质粒pYr-LVX-pri-mir141及空白对照质粒pLVX-IRES-ZsGreen1分别进行慢病毒包装并测定慢病毒滴度;不同的慢病毒颗粒侵染靶细胞UMUC3,构建miR-141过表达细胞株UMUC3-141及空白对照细胞株UMUC3-neg,检测UMUC3. UMUC3-neg及UMUC3-141中miR-141的表达水平。 结果酶切鉴定及测序结果显示pYr-LVX-pri-mir141表达质粒构建成功;荧光检测及滴度测定显示293T细胞慢病毒包装成功;实时荧光定量PCR检测结果显示,同UMUC3及UMUC3-neg细胞相比,UMUC3-141细胞株miR-141表达水平显著提高。 结论酶切鉴定及碱基测序比对结果表明miR-141过表达载体pYr-LVX-pri-mir141构建成功;膀胱癌miR-141过表达细胞株UMUC3-141及对照细胞株UMUC3-neg建立。 第三部分过表达miR-141对膀胱癌UMUC3(?)田胞株生物学行为的影响 目的检测过表达miR-141对膀胱癌UMUC3细胞株生物学行为的影响。 方法分别采用细胞划痕修复实验、transwell侵袭小室实验、MTT检测、平板克隆形成实验及流式细胞凋亡检测技术检测膀胱癌UMUC3、UMUC3-neg及UMUC3-141细胞的转移、侵袭、增殖、克隆形成及抗凋亡能力。 结果细胞划痕修复实验显示:48小时后,UMUC3、141细胞的划痕迁移率较UMUC3及MUC3-neg细胞显著降低;Transwell小室实验显示:36小时后,UMUC3-141细胞的细胞穿透数较UMUC3及UMUC3-neg细胞显著减少;MTT检测显示:UMUC3-141细胞增殖能力较另外两组明显降低;克隆平板克隆形成实验显示:三周后UMUC3-141细胞的克隆形成数较UMUC3及MUC3-neg细胞显著减少;凋亡检测显示三组细胞凋亡率无明显差异。 结论miR-141过表达可以降低膀胱癌UMUC3细胞株的侵袭、转移及增殖能力,但对其抗凋亡能力无明显影响。 第四部分miR-141与膀胱尿路上皮癌EMT、Wnt信号通路关系的初步探讨 目的探讨过表达miR-141对膀胱癌细胞株生物学行为影响的内在机制 方法生物信息学技术预测miR-141可能的靶基因;Western-blot检测不同miR-141表达水平下各预测靶基因的变化,将存在蛋白变化的靶基因作为最终靶基因;实时荧光定量PCR检测最终靶基因mRNA表达水平;检测不同miR-141细胞组EMT相关蛋白及Wnt信号通路相关蛋白的变化。 结果最终筛选出ZEB2和E3F2蛋白编码基因为miR-141靶基因;Western-blot检测显示,miR-141表达水平上调后,ZEB2及E3F2蛋白表达下调;EMT标志蛋白E-cadherin表达上调;Wnt信号通路下游蛋白CyclinD1及MMP-7表达下调。 结论过表达miR-141对膀胱癌细胞株UMUC3生物学行为的影响可能与其靶向调控ZEB2及E2F3有关;过表达miR-141介导的E-cadherin的表达上调不仅通过逆转EMT直接降低了肿瘤的侵袭和转移能力;而且导致了WNT/β-catenin信号通路的抑制,即CylinD1及MMP-7蛋白的表达降低,从而间接降低肿瘤的增殖能力及转移侵袭能力。


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