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赤芍801诱导类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞凋亡研究

彭爱红  
【摘要】:目的:探讨赤芍801对类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)成纤维样滑膜细胞(Fibroblast-like synoviocytes, FLS)凋亡的影响。 方法:RA患者关节滑液经原代培养分离出FLS,取3-5代的RA FLS用于后续实验。MTT检测细胞增殖抑制。根据MTT结果,将细胞分为高剂量赤芍801组(64μg/ml)、低剂量赤芍801组(4μg/ml)和溶剂对照组,光学显微镜观察其细胞形态;Annexin V-FITC/PI双标记染色检测细胞凋亡率;逆转录PCR和实时荧光定量PCR检测Fas/Fasl mRNA相对表达量;细胞免疫化学方法对P65和P50表达定位进行分析;提取核蛋白,采用免疫印迹方法检测P65和P50表达。 结果:经过反复贴壁与传代以后,3-5代滑膜细胞逐渐纯化,RA FLS在无赤芍801刺激下绝大多数为长梭形,少量呈星形、多角形,胞质透亮、均匀,核居中,排列具有局部方向性,低剂量赤芍801刺激24h后无明显改变,但高剂量赤芍801刺激后发生明显改变:细胞由长梭形变成了不规则形或圆形,细胞密度明显降低,体积缩小,核出现固缩,但胞膜和核膜完整。MTT结果显示,赤芍801具有浓度依赖性的抑制RA FLS增殖功能,并在4μg/ml剂量下有统计学意义,P0.05。流式结果表明,赤芍801具有诱导RA FLS凋亡功能,虽然低剂量组的凋亡率与对照组比较增加不明显,无统计学意义,P0.05,但高剂量组的凋亡率较对照组显著增加,具有统计学意义,P0.05。逆转录PCR结果显示,Fas mRNA在RA FLS中有表达,且有随赤芍801浓度增加而表达增加趋势,但Fasl mRNA在RA FLS中未被检测出。实时荧光定量PCR结果指出,低剂量赤芍801刺激的RA FLS Fas mRNA相对表达量较对照组增加不明显,差异无统计学意义,P0.05,但高剂量差异显著,有统计学意义,P0.05。细胞免疫化学结果显示,P65和P50蛋白在无赤芍801刺激作用下,主要在RA FLS细胞浆中被检测出,但当高剂量赤芍801浓度刺激24h后,二者在细胞核中的量增加。Western blotting结果指出,P65和P50在RA FLS核蛋白抽提物中被检出,并在高剂量赤芍801组中量显著高于对照组。 结论:赤芍801具有诱导RA FLS凋亡功能并引起Fas基因表达上调和NF-κB向核内转移。


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