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扶正化瘀方抗大鼠免疫性肝纤维化的实验研究

崔曼曼  
【摘要】:背景:我国是肝病大国,仅慢性HBV感染者就约有9300万人,其中慢性乙型肝炎患者约2000万例,而又约有12%~15%的慢性乙型肝炎患者在5年内发展到肝硬化。肝纤维化是各种慢性肝病发展至肝硬化的一个共同的中间病理过程,且具有可逆性,因此可以通过积极寻找阻止或治疗肝纤维化的有效方法,预防慢性肝病发展为肝硬化,甚至肝癌。 肝纤维化是由于各种致病因子导致的肝内结缔组织异常增生,其中肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)的活化是肝纤维化发生发展的中心环节,活化的HSC变成肌成纤维细胞(myofibroblast, MFB),具有高度的增殖和合成细胞外基质(extracellular matrix, ECM)的能力,是肝脏瘢痕组织的主要来源。在肝纤维化的发展过程中,随着ECM在Disse间隙的沉积,肝窦内皮细胞(liver sinusoidal endothelial cell, LSEC)的窗孔结构逐渐减少甚至消失,内皮下形成连续性基底膜,这一过程称为肝窦毛细血管化,是肝脏微循环障碍的重要病理机制,反过来又可以通过多种途径促进肝纤维化的发展。因此,可以通过研究如何阻止HSC活化和逆转肝窦毛细血管化来寻找有效抗肝纤维化的治疗药物。 扶正化瘀方(又称319方)是由丹参、虫草菌丝、桃仁、绞股蓝、松花粉、五味子组成,针对肝纤维化“瘀血阻络、正气虚弱”的基本中医病因研制而成。已在多种坏死后性肝纤维化动物模型及临床研究中显示了一定的抗肝纤维化作用,但对免疫性肝纤维化动物模型的作用研究尚未见报道。本课题组在前期研究中已从细胞水平验证了扶正化瘀方对HSC和LSEC两类细胞功能的影响,认为扶正化瘀方可以通过抑制HSC增殖、下调HSC分泌ECM和逆转肝窦毛细血管化来发挥抗肝纤维化作用,因此本研究以猪血清诱导的免疫性肝纤维化大鼠模型为基础,以干扰素-γ (Interferon-γ, IFN-γ)干预为阳性对照,研究扶正化瘀方对免疫性肝纤维化的治疗作用,并从HSC活化、分泌ECM及肝窦毛细血管化的角度探讨其抗肝纤维化的可能机制,为其临床应用提供进一步的理论依据。 第一部分扶正化瘀方对大鼠免疫性肝纤维化的治疗作用研究 目的观察中药扶正化瘀方对猪血清所致免疫性肝纤维化大鼠模型的治疗作用及对平滑肌肌动蛋白α (alpha-sooth muscle actin, α-SMA)、结蛋白(desmin)表达水平的影响。 方法腹腔注射猪血清8周构造大鼠肝纤维化模型,另设腹腔注射生理盐水的正常大鼠对照组,第9周起将造模大鼠随机分为模型组、IFN-γ组及扶正化瘀方组,IFN-γ组与扶正化瘀方组在继续给予腹腔注射猪血清的同时分别给予肌注IFN-γ、灌胃扶正化瘀方,模型组与正常组在继续分别给予腹腔注射猪血清、生理盐水的同时均给予灌胃等容积的消毒饮用水,代替扶正化瘀方,起对照作用,均至12周。末次给药后次日处死全部实验动物,取肝组织进行HE染色、Masson染色,按肝纤维化病理分期方案评价肝纤维化程度,并对胶原纤维面积百分比进行半定量分析:Western blot法检测各组α-SMA、desmin表达水平。 结果1.肝组织病理学结果显示扶正化瘀方组肝纤维化程度及胶原纤维面积百分比较模型组明显减轻,差异具有统计学意义(P0.01),而扶正化瘀方组、IFN-γ组组间无显著差异(P0.05);2.Western blot结果显示扶正化瘀方组α-SMA、desmin蛋白水平较模型组明显下调,差异具有统计学意义(P0.01),而扶正化瘀方组、IFN-γ组组间无显著差异(P0.05); 结论1.扶正化瘀方对大鼠免疫性肝纤维化有明显的改善作用:2.扶正化瘀方组α-SMA、desmin蛋白表达水平明显下调,胶原纤维面积百分比明显减低,提示其抗肝纤维化机制可能与抑制HSC活化和下调ECM分泌有关。 第二部分扶正化瘀方对免疫性肝纤维化大鼠模型肝窦毛细血管化的逆转作用研究 目的观察中药扶正化瘀方对猪血清所致免疫性肝纤维化大鼠模型肝窦毛细血管化的逆转作用。 方法获取第一部分实验各组的肝组织标本,Western blot法检测各组肝组织标本第Ⅷ因子相关抗原(von Willebrand factor, vWF)、CD31蛋白表达水平;透射电镜观察比较模型组和扶正化瘀方组肝窦结构与内皮下基底膜的改变。 结果1. Western blot结果显示扶正化瘀方组vWF.CD31蛋白表达水平较模型组明显下调(P0.05),而扶正化瘀方组、IFN-γ组组间无显著差异(P0.05);2.电镜结果显示与模型组相比,扶正化瘀方组肝窦扭曲狭窄程度、内皮窗孔消失和减少程度有所减轻,基底膜较薄或不连续,提示扶正化瘀方对免疫性肝纤维化大鼠肝窦毛细血管化有逆转作用。 结论扶正化瘀方可以逆转肝窦毛细血管化,这可能是扶正化瘀方抗肝纤维化作用的机制之一。


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