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天然衍生脱细胞牛心包膜复合BMP-2基因转染的骨髓间充质干细胞(BMSCs)引导骨组织再生的实验研究

白明海  
【摘要】:引导骨组织再生(Guide bone regeneration, GBR)是近年发展起来的一项促进组织再生愈合的新理论和新技术。它指利用膜的机械屏障作用,阻止病损区周围生长较快的其它组织细胞长入病损区,消除其它组织细胞的竞争性抑制作用,选择性引导特定细胞向病损的部位附着、增生,促进病损的修复。近年,种子细胞和生物活性因子的加入,复合化和功能化的GBR膜具有更好的引导骨组织再生作用。目前以天然衍生牛心包为基础制备复合功能GBR膜的研究较少,本研究分四个部分,首先以天然牛心包为来源通过脱细胞处理和交联处理制备出符合引导骨组织再生技术要求的天然衍生GBR膜;第二部分进行骨髓间充质干细胞(BMSCs)不同方向诱导培养和BMP-2基因转染BMSCs实验研究,为下一步复合GBR膜的研究打下基础;第三部分将天然衍生脱细胞牛心包膜与BMP-2基因转染的BMSCs体外复合,检测其生物相容性和细胞增殖等情况,为下一步动物实验打下基础;第四部进行天然衍生脱细胞牛心包膜复合BMP-2基因转染的BMSCs引导骨组织再生的初步动物实验研究,探讨脱细胞牛心包膜复合BMP-2基因转染的BMSCs临床上引导骨组织再生、修复骨缺损的可行性。 第一章天然衍生脱细胞牛心包膜的制备 目的:筛选出一种比较理想的天然衍生牛心包脱细胞处理和交联处理方法,为制备出符合临床要求的GBR膜材料打下基础。 方法: 1.天然牛心包膜采用胰酶去垢剂法(Ⅰ),胰酶核酸酶法(Ⅱ),胰酶去垢剂核酸酶联合法(Ⅲ),冻融后去污剂法(IV),冻融后核酸酶法(V),冻融后去污剂核酸酶联合法(Ⅵ)进行脱细胞处理,通过光镜、扫描电镜观察,细胞毒性实验,机械性能测定,细胞趋化性实验等,筛选出最佳脱细胞处理方法。 2.天然衍生脱细胞牛心包膜采用戊二醛和京尼平对其进行交联处理,通过光镜、扫描电镜观察,厚度检测,机械性能检测,交联指数测定,体外降解以及细胞毒性试验等,筛选出最理想脱细胞牛心包膜交联方法。 结果: 1.脱细胞结果表明:冻融去污剂核酸酶联合法处理后牛心包纤维排列致密有序,天然结构保存良好,细胞毒性低,是最理想的脱细胞方法。 2.交联结果表明:京尼平交联脱细胞牛心包膜比戊二醛交联效果具有更好生物相容性,交联效果好,是最理想的交联方法。 结论:冻融去污剂核酸酶联合法是制备脱细胞牛心包膜最理想的方法;京尼平交联的脱细胞牛心包膜具有更好生物相容性。 第二章骨髓间充质干细胞(BMSCs)多向诱导培养及BMP-2基因转染BMSCs实验研究 目的:探索兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)的分离培养方法并对BMSCs诱导,观察其多向培养潜能;进行BMP-2基因转染BMSCs实验,为GBR复合膜研究打下基础。 方法: 1.贴壁培养法分离培养兔BMSCs,相差显微镜观察BMSCs的生长增殖情况;取生长状态良好的第2代BMSCs,分别用成骨、成脂、成软骨诱导培养基对其进行诱导培养,然后检测BMSCs多向培养生长情况。 2.传代培养良好的BMSCs,通过质粒载体,采用电穿孔法转染BMP-2基因,然后进行下列鉴定:荧光显微镜观察BMP-2转染BMSCs生长增殖情况;RT-PCR检测转染细胞的BMP-2mRNA表达;Westeblot检测BMP-2在蛋白水平的表达;ALP检测评价其成骨分化能力。 结果: 1.兔原代及传代BMSCs细胞生长良好;成骨诱导实验ALP染色结果阳性,茜素红染色阳性;成脂诱导实验油红O染色结果阳性;成软骨诱导实验Ⅰ型胶原和Aggrecan免疫化学染色阳性。 2.BMP-2转染BMSCs的转染效率为41.2士1.1%;RT-PCR结果表明BMP-2RNA表达阳性,Westernblot结果表明转染BMSCs可有效表达转染基因;BMP-2转染的BMSCs的ALP活性明显高于空白转染组。 结论: 1.原代培养兔BMSCs具有多向生长能力,可成功诱导培养为脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞。 2.BMP-2基因可有效成功转染BMSCs,从而为下步复合GBR膜研究打下基础。 第三章脱细胞牛心包膜复合BMP-2转染的BMSCs引导骨再生的体外实验研究 目的:探讨脱细胞牛心包复合BMP-2基因转染的BMSCs材料的生物相容性,细胞毒性及BMSCs在牛心包膜材料上的贴附、生长、增殖及成骨分化情况。 方法:脱细胞牛心包膜体外复合BMP-2转染的BMSCs,通过扫描电镜评估细胞在脱细胞牛心包支架材料上的的贴附、生长与增殖情况,MTT检测膜材料对转染细胞的细胞毒性,ELISA检测BMP-2含量,结晶紫染色法测定BMSCs细胞粘附能力检测, ALP活性实验检测转染BMSCs成骨性能。 结果: 1.扫描电镜结果表明:脱细胞牛心包复合BMP-2基因转染的BMSCs后,细胞能良好的贴附并增殖。 2.细胞毒性检测结果表明,各组细胞的存活率没有明显差异。 3.细胞粘附能力检测结果表明:脱细胞牛心包膜增强了BMP-2转染BMSCs细胞粘附能力。 4.ALP活性检测、Westernblot检测和RT-PCR检测结果表明:脱细胞牛心包膜增强了BMP-2转染BMSCs向成骨细胞转化的能力。 结论:脱细胞牛心包复合BMP-2基因转染的BMSCs功能膜有良好的生物相容性和细胞相容性,可能具备更佳的引导骨再生能力。 第四章脱细胞牛心包膜复合BMP-2转染的BMSCs引导骨再生的动物实验研究 目的:将脱细胞牛心包复合BMP-2基因转染的BMSCs构建的功能膜植入兔下领骨骨缺损处,探讨其引导骨组织再生情况。 方法:建立兔下颌骨骨缺损模型,分别植入BMP-2转染的BMSCs/脱细胞牛心包复合体(A组)、单纯脱细胞牛心包材料(B组),同时设立空白对照(C组),分别于术后第4、8、12周行大体肉眼观察,X线检测和组织形态学检测,观察其成骨情况。 结果:大体肉眼观察、X线检测、组织形态学检测结果表明:术后第8周及第16周实验组A,B组骨缺损愈合情况与C组(空白对照)有显著差异,且A组优于B组(p0.05)。 结论:脱细胞牛心包复合BMP-2基因转染的BMSCs功能膜可更加有效促进兔下颌骨骨缺损修复。


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