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人膝骨关节炎滑液蛋白质组学研究及国人骨关节炎流行病学Meta分析

潘丁  
【摘要】:研究背景 骨关节炎是一种常见的衰老性疾病,严重危害中老年人身心健康。其发病有着明显的性别、年龄和地域分布特点,在中国及其他发展中国家发病率较高。虽然研究结果认为骨关节炎的发病与软骨退变、遗传因素和环境因素等密切相关,但骨关节炎的具体发病机制目前仍然不十分清楚。由于缺乏骨关节炎早期诊断和病程监测的特异性分子生物标记物,大多数骨关节炎患者确诊时已经处于中晚期。骨关节炎患者如能早期确诊并进行早期干预,可避免关节结构和功能进一步恶化,进而降低中晚期骨关节炎的发生率和致残率。因此发现新的骨关节炎分子生物标记物将有助于骨关节炎的早期诊断、治疗和发病机制的研究。 近年来,新兴的蛋白质组学相关技术已经成为研究包括骨关节炎的临床各类慢性疾病筛查和早期诊断蛋白质分子生物标记物的有效工具,同时也为骨关节炎发生和发展的具体机制研究提供了可靠的技术平台。常用的蛋白质组分析技术为双向聚丙烯酰胺凝胶电泳法(two dimensional gel electrophoresis,2-D GE),但该方法存在敏感性、特异性、重复性较差的缺点,并且对小分子蛋白、疏水蛋白和膜蛋白的分离有诸多的限制性。因此采用更高通量、更精确的定量蛋白质组学技术方法显得尤为必要。基于稳定的同位素标记与反相液相色谱-质谱联用的定量蛋白质组学技术是目前蛋白质组学研究技术中发展较快的领域,其中18O稳定同位素标记具有技术相对简单、试剂较便宜、处理步骤少和易于大批量检测等的优点,在定量蛋白质组学研究领域中受到越来越多的关注。 骨关节炎关节软骨、滑膜和滑液组织与其同起源的正常组织的比较蛋白质组学研究为骨关节炎分子标志物的确定和靶向治疗药物的设计提供了最直接和最合理的研究途径。然而,采用组织样本进行相关蛋白质组学技术研究存在组织异质性等的主要障碍。因此,为提高比较蛋白质组学技术研究中筛查骨关节炎分子标志物的有效性,有必要将尽可能多的异质性来源的标本等量混合,用于蛋白质组学研究。 为了分离和鉴定骨关节炎相关蛋白质分子,筛查骨关节炎分子靶标,本研究选用9例骨关节炎患者和9例正常人的膝关节滑液两组进行各等量混合后,采用透明质酸酶酶解增加黏度的透明质酸,进而用18O稳定同位素标记其中一组后混合,利用反相液相色谱-质谱联用的定量蛋白质组学方法分离鉴定两种滑液间的差异蛋白。进一步通过生物信息学的方式验证并探讨差异蛋白的功能相关性和临床病理意义。最后通过系统综述和Meta分析对文献中骨关节炎的流行病学横断面调查研究进行整合分析,为临床骨关节炎预防控制和预后判断提供循证医学证据。 第一章同位素标记结合RPLC-MS构建人膝骨关节炎关节滑液差异表达蛋白质组谱 目的:研究放射性同位素标记结合纳升级反相液相色谱串联质谱(Nano-RPLC-MS/MS)在膝关节骨关节炎患者关节滑液中的应用,了解骨关节炎关节滑液的蛋白组学差异,探索骨关节炎早期诊断的分子标志物。 方法:选用9例骨关节炎患者(实验组)和9例正常人(对照组)的膝关节滑液标本,应用1D-SDS-PAGE技术预分离两组样本总蛋白,优化稳定高效的18O/16O标记技术,并用18O/16O分别标记两组滑液的多肽混合物,Nano-RPLC-MS分离鉴定差异蛋白质。 结果:通过电泳预分离达到了去除高峰度蛋白的作用,建立了稳定高效的18O标记技术,共分离鉴定出38种差异蛋白。代表差异蛋白包括:TTHY_HUMAN (Transthyretin)、APOA1_HUMAN (Apolipoprotein A-I)、HEMO_HUMAN (Hemopexin)、C03_HUMAN (Complement C3)、PRG4_HUMAN (Proteoglycan4) VTDB_HUMAN (Vitamin D-binding protein)。 结论:18O稳定同位素标记结合RPLC-MS技术定量蛋白质组学能够准确定量并鉴定骨关节炎差异蛋白,并成功地构建了骨关节炎差异表达蛋白质谱,为骨关节炎早期诊断和筛查提供了新的技术和思路,为筛选骨关节炎分子标志物和设计药物靶点提供了一定的实验基础和有用的生物学信息。 第二章人骨关节炎关节滑液差异蛋白的生物信息学分析 目的:对差异蛋白的功能网络等信息进行预测,并构建膝骨关节炎的关节滑液蛋白质组数据库。 方法:采用基因本体论(gene ontology,GO)GO从细胞组分、分子功能和生物过程层次分析差异蛋白所占的比重,采用STRING v9.1分析差异蛋白质之间相互作用的关系网络。 结果:根据对细胞组分的GO分析,差异蛋白中血浆脂蛋白颗粒比重最大,占35%,其次为极低密度脂蛋白,占22%。根据对分子功能的GO分析,差异蛋白中serine-type肽链内切酶抑制剂和酶抑制剂活性较强,分别占15%和14%。根据对生物过程的GO分析,差异蛋白中以急性期炎症反应和创伤后应激反应为主。差异蛋白的STRING分析显示除了少数功能相对独立的蛋白外,大多数蛋白在发挥功能中有协同作用或其他相互作用。 结论:生物信息学技术可用于差异蛋白的功能预测和相互作用网络分析,骨关节炎滑液中差异蛋白以酶抑制剂为主,脂蛋白及局部炎症反应在骨关节炎发病中发挥一定作用。 第三章国入骨关节炎流行病学Meta分析 背景:骨关节炎的患病率在全世界不同人种中存在差异,并且在近些年成不断增长趋势。现今的研究认为骨关节炎是影响居民生活治疗的一种独立的风险因素。但是目前并没有确切的关于中国人骨关节炎患病率的系统综述和Meta分析。 目的:探讨国人骨关节炎发病率的特点,为其防治提供理论依据。 方法:通过中国期刊全文数据库、中国生物医学文献数据库、重庆维普中文科技期刊数据库和万方数据知识服务平台,手工和在线检索已发表的关于中国人骨关节炎的流行病学研究。在英文杂志中报道的采用以下数据库检索:MEDLINE数据库,Elsevier: ScienceDirect数据库,BIOSIS Previews数据库。纳入文献为采用严格筛查和诊断标准的原始研究。根据异质性采用随机效应模型计算。 结果:共纳入55篇横断面研究,资料分析显示,膝关节骨关节炎患病率为男性14.2%(95%CI:11.0%-18.1%),女性24.4%(95%Cl:19.3%-30.3%),年龄风险值为男性65岁,女性55岁,东部和北部高于南部和西部。其余关节男性的合并患病率如下:颈椎(95%CI:3.3%-14.8%),胸椎(95%CI:0.2%-0.5%),腰椎12.8%(95%CI:7.1%-22.0%),手3.0%(95%CI:1.1%-8.1%),髋关节0.8%(95%CI:0.1%-7.4%),骶髂关节0.0%(95%CI:0.0%-0.1%),踝关节0.2%(95%CI:0.1%-0.4%),肩关节0.4%(95%CI:0.0%-3.8%),腕关节0.3%(95%CI:0.2%-0.6%),肘关节0.2%(95%CI:0.0%-2.4%),足0.2%(95%CI:0.1%-0.6%);女性的合并患病率如下:颈椎11.1%(95%CI:5.2%-22.1%),胸椎0.5%(95%CI:0.2%-0.8%),腰椎17.3%(95%CI:10.4%-27.4%),手6.2%(95%CI:2.7%-13.3%),髋关节0.6%(95%CI:0.1%-3.0%),骶髂关节0.1%(95%CI:0.0%-0.2%),踝关节0.4%(95%CI:0.1%-1.2%),肩关节0.6%(95%CI:0.1%-5.6%),腕关节0.6%(95%CI:0.4%-0.9%),肘关节0.2%(95%CI:0.0%-2.5%),足0.3%(95%CI:0.1%-1.0%)。 结论:国人骨关节炎的患病率与性别、年龄和地域分布有关,女性患病率均高于男性,膝关节骨关节炎的发病在男性65岁、女性55岁为发病风险年龄,且呈现东部和北部高于西部和南部的特征。


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