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嗜酸氧化硫硫杆菌的全基因组测序及硫氧化途径研究

张宪  
【摘要】:摘要:浸矿微生物以其独特的生理生化性质和功能,广泛应用于生物冶金领域。目前,已完成测序的基因组较少,阻碍了对其的基础研究及进 一步开发利用。作为浸矿复合菌系的主要组分之一,嗜酸氧化硫硫杆菌(Acidithiobacillus thiooxidans)能够利用元素硫和无机硫化合物作为能源物质,同时其代谢产物硫酸对于维持浸矿体系pH、促进浸矿过程至关重要。基于持续发展的高通量测序技术,本论文选取一株典型浸矿微生物A. thiooxidans A01进行全基因组测序,并对基因组序列进行生物信息学分析,旨在为以后的研究工作提供指导性的依据。 使用深圳华大基因Illumina Hiseq2000对A. thiooxidans A01进行全基因组测序,并对原始数据进行过滤、拼接组装,最终获得基因组草图。草图共有213条contig,组装大小3,820,158bp, G+C含量53.08%。通过Glimmer软件对基因组进行基因预测,并选用NR-DB、COG和KEGG数据库进行基因注释。基因组包含3,660个编码序列(CDSs),其中2,537对应为已知功能蛋白,136为保守假设蛋白,987为假设蛋白。tRNAscan-SE预测tRNA111个,RNAmmer预测5S-16S-23S操纵子1个。基因组序列提交至GenBank数据库,登录号为AZMOOOOOOOOO。 通过进一步分析,我们得知,该浸矿菌中包含一系列与硫氧化系统相关的代谢酶如硫双加氧酶(sulfur dioxygenase)、硫化物醌还原酶(sulfide quinone reductase)、硫代硫酸盐-辅酶Q氧化还原酶(thiosulfat-e:quinone oxidoreductase)、连四硫酸盐水解酶(tetrathionate hydrolase)、硫氧化蛋白(sulfur oxidizing protein)等以及电子传递体。因为嗜酸氧化硫硫杆菌中不存在硫酸腺苷酰转移酶,所以在嗜酸氧化硫硫杆菌的细胞质中存在一条与喜温硫杆菌(Acidithiooxidans caldus)不同的代谢途径:它是以亚硫酸盐作为底物,在磷酸腺苷磷酰硫酸还原酶(phosph-oadenosine phosphosulfate reductase)和腺苷酰硫酸激酶(adenylylsulfate kinase)的催化作用下,经过一系列反应得到最终产物硫酸盐。 本研究首次在A. thiooxidans A01的基因组中鉴定到sor基因,经分析,我们确定了该基因能够编码由311个氨基酸组成的蛋白酶——硫氧化还原酶(sulfur oxygenase reductase)。以腾冲嗜酸两性菌(Acidianus tengch-ongensis)中硫氧化还原酶的晶体结构(3BXV)作为模板,使用软件Discovery Studio2.5构建出A. thiooxidans A01中硫氧化还原酶的同源模型。分析其空间结构,发现该酶的活性位点包括三个半胱氨酸(分别位于两个保守区域:C32位于V-G-P-K-V-C32, C102和C105位于C102-X-X-C105)以及一个保守模体H87-X3-H91-X23-E115。前者可能形成底物活化和结合位点,而后者通过结合一个铁原子形成单核的非卟啉铁中心,催化底物的氧化反应。 根据硫氧化途径相关的基因序列设计引物进行实时定量PCR(qRT-PCR),结果显示,在细菌生长对数中期时,S-培养基中与硫氧化系统相关的绝大多数基因的表达量明显高于Na2S2O3中的。结合基因组草图、生物信息学分析及qRT-PCR的数据,构建了较为完善的硫氧化途径模型。


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