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脑溢安对脑出血大鼠脑内和缺氧损伤神干细胞内BDNF、GDNF表达的影响

武衡  
【摘要】: 目的:脑出血(Intracerebral hemorrhage ICH)是急性脑血管病中危重类型,其死亡率较高,即使有幸存活下来,也约有60%-80%的患者遗留有不同程度的神经功能障碍。脑出血造成神经功能障碍的主要原因是血肿周围神经元的变性坏死或凋亡。神经营养因子具有促进受损神经元存活、调节突触可塑性、刺激轴突生长等多方面的生理功能;而神经干细胞是神经细胞再生的种子细胞,具有多分化潜能,脑损伤后,神经干细胞能增殖、分化为神经系统的三类细胞:神经元、星型胶质细胞、少突胶质细胞,恢复受损区域的结构重建、功能整合,以修复受损的神经功能。虽然脑出血损伤本身可启动中枢神经系统的神经保护机制而促进内源性神经营养因子的释放及神经干细胞的激活,但是神经营养因子的释放可能存在持续时间短及分泌量不足的情况,而神经干细胞在激活后大部分分化为神经胶质,分化为神经元的比例很低。因此,提高内源性神经营养因子的表达和分泌,改变神经干细胞的分化方向,都将成为各种脑出血治疗药物的作用靶点。脑溢安(Naoyi-an,NYA)是治疗脑出血(急性期)的国家三类中药新药,临床疗效确切;在以往研究基础上,本实验从脑溢安对脑出血后脑内脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)、胶质细胞源性神经营养因子一(glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF)分泌的影响和对神经干细胞分化、缺氧损伤保护作用两方面来探讨脑溢安治疗脑出血的脑保护作用机制。 方法:体内实验(1)大鼠脑出血模型的制作:应用鼠脑立体定位仪,通过微量注射器将0.4UⅧ胶原酶注入成年SD大鼠右侧苍白球内;(2)应用免疫组化技术研究脑出血大鼠脑内BDNF、GDNF在脑出血后分布、不同时间点的表达差异以及脑溢安对其表达的影响;(3)应用原位杂交技术研究脑出血大鼠脑内BDNFmRNA、GDNFmRNA在脑出血后的分布、不同时间点的表达差异及脑溢安对其表达水平的影响;体外实验(1)从新生3—5天大鼠海马分离培养神经干细胞;(2)脑溢安血清制备:大鼠用脑溢安浸膏连续灌胃3天后,心脏内采血分离出血清;(3)缺氧损伤神经干细胞模型:培养的神经干细胞移入厌氧培养箱(37~oC、95%N_2、5%CO_2)内培养6h;(4)应用免疫细胞化学方 博十学位论文 摘要 法川TT法研究脑溢安血清对体外培养神经干细胞分化及存活的影响; u)应用免疫细胞化学技术研究BDNF、GDNF蛋白在体外培养正常神 经干细胞和缺氧损伤神经干细胞中的表达以及脑溢安的影响。 结果:门)正常组、假手术组大鼠脑内均未见明显BDNF、GDNF 蛋白表达,脑出血损伤后BDNF、GDNF两类阳性细胞的表达均局限于 血肿及血肿周围区域,损伤对侧、皮质、海马等区域均未见上述两类 蛋白的表达。脑出血损伤后 Zh即出现 BDNF、GDNF蛋白的表达,id 达高峰,4d后开始下降,7d后仍有较弱的表达,14d后GDNF阳性细 胞消 失,而BDNF的表达与第 7d卜较无明显差异。经 BDNF不 OX-42 免疫荧光双标法证实BDNF主要表达于血肿周围的活化小胶质细胞; 从GDNF阳性细胞形态分析,GDNF主要表达于血肿周围的活化星形胶 质细胞。脑溢安组 BDNF、GDNF蛋白的表达在 id、4d强于模型组,两 组阳性细胞计数表明差异有显著性u的.05),提示脑溢安能上调上 述两种蛋白的表达。Q)正常组、假手术组大鼠脑内皮质、海马、纹 状体等处有BDNFnRNA的表达;GDNFnRNA在纹状体、皮层、海马有极 弱的表达。脑出血后Zh,大脑皮质、海马、纹状体、基底前脑、黑 质、脐服体,血肿周围等出现BDNF。RNA、GDNFmRNA的表达增高,但 血肿中心区域未见表达信号,6h后上述部位表达信号继续增强,id 后达高峰,4d后表达开始减弱,7d后两考的表达水平继续下降但仍 高于正常,14 d后 BDNFmRNA、GDNFmRNA阳性细胞数量及表达水平降 至基础水平。两者的阳性细胞主要表达于神经无,脑溢安组BDNFmRNA。 GDNFmRNA表达信号在损伤后 6h、id、4d明显强于模型组,两组阳性 细胞计数比较有显著性差异u.of),表明脑溢安能上调脑出血后 BDNFmRNA、GDNFmRNA的表达水平。O)向正常培养的神经干细胞中 加入脑溢安血请或正常血清后,脑溢安血清组NF200阳性细胞比例 明显高于正常血清组吓优.05人MTT法显示脑溢安血清组OD值高于 正常血清对照组u①.01人 N)正常神经干细胞内未见 BDNF、GDNF 蛋白的表达,缺氧损伤神经干细胞内BDNF、GDNF蛋自表达增强,脑 溢安血清组BDNF、GDNF 蛋白的表达水平均高于正常血清对照组 (P<0.05)。 结论:*)脑出血损伤大鼠脑内BDNF、GDNF蛋白及mRNA的表达 均增强,脑溢安能上调BDNF、GDNF蛋白及mRNA的表达水平。()脑 溢安可促进神经干细胞向神经元方向分化,提高神经干细胞分化为神 经无的比率,并具有促进神经细胞存活的作用。门)缺氧损伤后,神 二 博十学位论文 摘要 经干细胞内BDNF、GDNF蛋白表达增强,脑溢安能上调缺氧损伤神经 干细胞内 BDNF、GDNF蛋白的表达。K)


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