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脂多糖诱发肝损伤的分子机理和蛋白质组学研究

刘小伟  
【摘要】: 脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)是革兰氏阴性细菌内毒素的主要成分,也是革兰氏阴性细菌激发宿主免疫应答,导致机体损伤的重要因素。人体集聚革兰氏阴性杆菌最丰富的部位是肠道,其所产生的LPS经吸收首先到达肝脏,作为机体主要解毒器官的肝脏,无疑是清除LPS的最活跃场所,但也是免疫损伤的最常见靶位。LPS不但可加重肝硬化、酒精性肝病肝损伤,而且明显增强CCl_4和乙醇等肝毒性物质的肝毒性,单独LPS亦可导致肝损伤。但LPS引起肝损伤过程中涉及的具体信号转导分子及效应分子尚不清楚。 本研究运用常规分子生物学和免疫组织化学方法,动态分析LPS刺激不同时段肝脏LPS/TLR_4途径信号分子及功能分子TNF-α表达与肝脏病理变化的关系,同时比较LPS肝损伤发展不同时相蛋白质组变化,从蛋白质整体水平动态捕捉LPS肝损伤信号转导途径中的特异蛋白质“指纹”,搜查参与到该信号通道的信号、效应分子,探索LPS致肝损伤的发生机理。 首先,Balb/c鼠腹腔注射LPS建立急性内毒素血症动物模型,分别在3小时、6小时、12小时、24小时、30小时处死动物取肝脏组织,HE染色观察病理改变,免疫组织化学方法检测肝细胞凋亡 禾月组织TNF-a的表达,逆转录PCR(RT-PCR)法检狈肝组织信号 分子 1”LR。(Tolllike Receptor 4,TLR.)、MyD88(Myeloid Differential Factor 88,MvD88)mRNA 7k平的表达。结果表明, 腹腔注射 LPS后 0、 小时小鼠一般情况无明显改变,肝组织学变 化不明显,24小时小鼠肝脏出现明显炎性浸润、坏死;而3~6 ’J’ 时肝细胞凋亡和肝组织 TNF-口的表达达到高峰,12小时即明显减 少,24小时凋亡、坏死并存,以坏死为主;肝组织 TLR4mRNA的表 达在注射LPS后3小时开始下调,6、12小时明显抑制,24小时则 基本恢复:肝组织W088mRNA的表达在不同时间点变化不明显。 然后,本研究为探讨LPS诱发肝损伤相关蛋白质群的变化规 律,动态分析了LPS刺激不同时段肝脏的蛋白质谱型。在上述动物 实验基础上,匀浆抽提肝脏总蛋白进行双向凝胶电泳,从蛋白质表 达丰度角度,寻找差异表达蛋白质;对差异表达蛋白质斑点胰酶酶 解后用MALDITOF攸S作肽指纹图,结合蛋白质数据库搜索进行蛋 白质鉴定,并分析各差异蛋白质在内毒素肝损伤中的作用。结果 发现腹腔注射LPS后6 ’J’时(早期人 蛋白质谱显示TNF-a相关蛋 白TNFAIPI(TNF-a inducible endothelial protein,TNFAIPI) 表达明显上调,TRA IL受体2蛋白表达下调,线粒体相关蛋白 MetaxinZ、TIMMSA(Mitochondrlal import Inner membrane translocase subunit TIMS A,TIMMSA)开始表达上调,部分蛋白 酶体相关蛋白质如磷脂酶AZ、PA28(proteasome activator 28, PA28)、MDPP(Maggesiumdependent protein phosphatase,MDPP) V 等的表达被抑制;24小时(后期,包括30小时3只小鼠死亡)的 蛋白质谱显示,TRAIL受体2表达抑制,线粒体相关蛋白MetaxinZ、 TIMMSA达到表达高峰,蛋白酶体相关蛋白磷脂酶AZ、PA28、MDPP 恢复表达,并开始表达增殖相关蛋白P34d*激酶。 本研究结果提示,LPS致肝损伤呈时间依从性:早期,TNF- a相关蛋白出现表达高峰,线粒体凋亡途径相关蛋白质开始表达上 调,出现以TNF-口为中心的肝细胞凋亡,肝组织TLR.mRNA的表达 表现为抑制状态;中后期,线粒体凋亡途径相关蛋白质达到表达高 峰,肝组织出现明显病理变化,凋亡和坏死并存,以坏死为主,同 时机体开始启动损伤修复程序,肝组织TLR.mRNA的表达开始恢复, 与肝脏的病理变化在时间上呈一致性,可能与LPS耐受性产生有关, 提示LPS信号传导分子TLR.在介导肝损伤中起重要作用,而 MmD88mRNA的表达在LPS刺激不同时限无明显变化,提示其为胞内 保守信号分子。


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