脂多糖诱发肝损伤的分子机理和蛋白质组学研究

【摘要】： 脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)是革兰氏阴性细菌内毒素的主要成分，也是革兰氏阴性细菌激发宿主免疫应答，导致机体损伤的重要因素。人体集聚革兰氏阴性杆菌最丰富的部位是肠道，其所产生的LPS经吸收首先到达肝脏，作为机体主要解毒器官的肝脏，无疑是清除LPS的最活跃场所，但也是免疫损伤的最常见靶位。LPS不但可加重肝硬化、酒精性肝病肝损伤，而且明显增强CCl_4和乙醇等肝毒性物质的肝毒性，单独LPS亦可导致肝损伤。但LPS引起肝损伤过程中涉及的具体信号转导分子及效应分子尚不清楚。 本研究运用常规分子生物学和免疫组织化学方法，动态分析LPS刺激不同时段肝脏LPS／TLR_4途径信号分子及功能分子TNF-α表达与肝脏病理变化的关系，同时比较LPS肝损伤发展不同时相蛋白质组变化，从蛋白质整体水平动态捕捉LPS肝损伤信号转导途径中的特异蛋白质“指纹”，搜查参与到该信号通道的信号、效应分子，探索LPS致肝损伤的发生机理。 首先，Balb／c鼠腹腔注射LPS建立急性内毒素血症动物模型，分别在3小时、6小时、12小时、24小时、30小时处死动物取肝脏组织，HE染色观察病理改变，免疫组织化学方法检测肝细胞凋亡 禾月组织TNF－a的表达，逆转录PCR（RT－PCR）法检狈肝组织信号 分子 1”LR。（Tolllike Receptor 4，TLR．）、MyD88（Myeloid Differential Factor 88，MvD88）mRNA 7k平的表达。结果表明， 腹腔注射 LPS后 0、 小时小鼠一般情况无明显改变，肝组织学变 化不明显，24小时小鼠肝脏出现明显炎性浸润、坏死；而3～6 ’J’ 时肝细胞凋亡和肝组织 TNF－口的表达达到高峰，12小时即明显减 少，24小时凋亡、坏死并存，以坏死为主；肝组织 TLR4mRNA的表 达在注射LPS后3小时开始下调，6、12小时明显抑制，24小时则 基本恢复：肝组织W088mRNA的表达在不同时间点变化不明显。 然后，本研究为探讨LPS诱发肝损伤相关蛋白质群的变化规 律，动态分析了LPS刺激不同时段肝脏的蛋白质谱型。在上述动物 实验基础上，匀浆抽提肝脏总蛋白进行双向凝胶电泳，从蛋白质表 达丰度角度，寻找差异表达蛋白质；对差异表达蛋白质斑点胰酶酶 解后用MALDITOF攸S作肽指纹图，结合蛋白质数据库搜索进行蛋 白质鉴定，并分析各差异蛋白质在内毒素肝损伤中的作用。结果 发现腹腔注射LPS后6 ’J’时（早期人 蛋白质谱显示TNF－a相关蛋 白TNFAIPI（TNF－a inducible endothelial protein，TNFAIPI） 表达明显上调，TRA IL受体2蛋白表达下调，线粒体相关蛋白 MetaxinZ、TIMMSA（Mitochondrlal import Inner membrane translocase subunit TIMS A，TIMMSA）开始表达上调，部分蛋白 酶体相关蛋白质如磷脂酶AZ、PA28（proteasome activator 28， PA28）、MDPP（Maggesiumdependent protein phosphatase，MDPP） V 等的表达被抑制；24小时（后期，包括30小时3只小鼠死亡）的 蛋白质谱显示，TRAIL受体2表达抑制，线粒体相关蛋白MetaxinZ、 TIMMSA达到表达高峰，蛋白酶体相关蛋白磷脂酶AZ、PA28、MDPP 恢复表达，并开始表达增殖相关蛋白P34d＊激酶。 本研究结果提示，LPS致肝损伤呈时间依从性：早期，TNF－ a相关蛋白出现表达高峰，线粒体凋亡途径相关蛋白质开始表达上 调，出现以TNF－口为中心的肝细胞凋亡，肝组织TLR．mRNA的表达 表现为抑制状态；中后期，线粒体凋亡途径相关蛋白质达到表达高 峰，肝组织出现明显病理变化，凋亡和坏死并存，以坏死为主，同 时机体开始启动损伤修复程序，肝组织TLR．mRNA的表达开始恢复， 与肝脏的病理变化在时间上呈一致性，可能与LPS耐受性产生有关， 提示LPS信号传导分子TLR．在介导肝损伤中起重要作用，而 MmD88mRNA的表达在LPS刺激不同时限无明显变化，提示其为胞内 保守信号分子。