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人成熟型TGF-β_1基因克隆、表达及其多克隆抗体的制备与初步临床应用

龚环宇  
【摘要】: 目的:转化生长因子β_1是目前已知最强的致肝纤维化细胞因子。血清TGF-β_1与肝纤维化的关系及其在早期纤维化的诊断意义已越来越引起人们的重视。本研究旨在克隆人成熟型TGF-β_1基因并获得人成熟型TGF-β_1融合蛋白,将其免疫兔,获得兔抗人成熟型TGF-β_1多克隆抗体,并初步应用于临床。 方法:首先,分离并培养慢性乙型肝炎病人外周血单个核细胞,提取其总RNA,通过逆转录巢式PCR获得人成熟型TGF-β_1编码区基因片断,构建含目的基因的T载体克隆及原核细胞表达载体亚克隆,并经酶切、测序证实。IPTG诱导表达TGF-β_1融合蛋白,Western-blot证实其抗原性。将重组基因工程菌扩大诱导表达,亲和层析法纯化诱导的蛋白。继而,将纯化的蛋白与弗氏佐剂乳化,将其作为抗原免疫兔,获得兔抗人血清,经饱和硫酸铵纯化,获得初步纯化的兔抗人TGF-β_1多克隆抗体。第三,用双抗夹心ELISA法测定正常对照,轻中度慢性肝病,重度慢性肝病,肝硬化患者血清TGF-β_1血清浓度,与国外进口标准化人TGF-β_1 ELISA试剂盒检测结果比较,从而初步探讨血清TGF-β_1与慢性肝病的关系。 结果: 1.获得人成熟型TGF-β_1编码区基因片段,并经测序证实。 2.获得人TGF-β_1基因重组基因工程菌的克隆,并表达具有抗原性的TGF-β_1融合蛋白。 3.获得纯化的TGF-β_1融合蛋白,并用其免疫兔子。 4.获得初步纯化的兔抗人TGF-β_1特异性多克隆抗体,能与人TGF- p;起反应。 5.慢性肝炎或肝硬化患者的血清TG卜p;的水平是上升的呼< 0刀5人 提示在慢性肝病时血清TGF-p;的浓度是逐渐增高的。与国 外标准化TGF小;ELISA试剂盒检测结果比较有较好的相似性。 结论:经重组基因工程菌诱导表达的TGF e;融合蛋白具有免疫 原性,将其作为免疫原制备的兔抗人TGFJ;多克隆抗体能与TGF- p;融合蛋白发生反应,且特异性和敏感性均良好,可初步用于临床 TGF小;的检测,将其固相包被或酶标等处理后有望建立检测早期肝 纤维化病人血清TGF小;的诊断试剂盒。


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