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日本血吸虫新基因克隆及DNA疫苗的构建和保护性研究

张冉  
【摘要】: 血吸虫病是严重危害人类、牲畜健康的寄生虫病。虽然采取大规模人畜同步化疗及易感地带灭螺等措施后,血防工作取得了重大成绩,但由于再感染及反复化疗费用等问题,免疫预防血吸虫病已成为当今研究工作的重点。DNA疫苗(或称核酸疫苗)是90年代新发展起来的疫苗,具有易于制备和纯化,化学和生物学性质稳定,不需冷藏,便于保存和运输,来源不受限制,作用时间长,目的抗原在细胞内表达,类似于天然抗原,可诱发细胞毒淋巴细胞应答并同时刺激抗体的产生等优点。本研究利用水牛对日本血吸虫有一定自然抵抗力这一特性,免疫筛选出日本血吸虫新的抗原分子,并构建成DNA疫苗,与本室已构建的DNA疫苗均进行免疫保护性评价及机理探讨。 一、新的日本血吸虫DNA疫苗及重组蛋白疫苗的筛选、构建、保护效果及机理研究 (一)水牛感染血清免疫筛选日本血吸虫成虫cDNA文库 感染日本血-吸虫(Schistosoma japonicum,Sj)的水牛(Bubalus bubaiis,Bb or Buffalo)是我国湖沼型疫区血吸虫病的主要传染源,已证明对感染有相对抵抗力,主要表现在感染率及感染度低,自然感染水牛排卵期较其他易感动物短,是对日本血吸虫有一定自然抵抗力的动物。为寻找有效的日本血吸虫疫苗候选分子,本研究用感染水牛血清为探针,对Sj成虫cDNA文库进行免疫筛选。三轮筛选后,将7个阳性克隆经辅助噬菌体自动剪切并PCR扩增显示,插入的Sj cDNA片段大小在0.8kb至2kb之间,选取其中4个经DNA测序分析,发现2个未曾报道过的Sj新基因,分别命名为Sj-IB1和Sj-Rho GTPase,并在GeneBank上登记注册。结果说明Bb感染血清可识别Sj的一些特殊抗原分子,这些抗原分子的免疫保护作用值得进一步研究。 (二)日本血吸虫Rho GTPase DNA疫苗及重组蛋白疫苗的构建和免疫保护效果研究 将以日本血吸虫感染水牛血清筛选Sj成虫cDNA文库所获得的新基因Sj-Rho GTPase(登录号为AF521619)分别克隆至真核表达载体pcDNA3.1和原核表达载体pGEX-5X-3中,构建成DNA疫苗及重组蛋 白疫砧,才采用KR、双附切、钓序、***CE、仇疫印记法等方法 对其5 刁 鉴定、分析,1 二卫“ *。大上班 地纯化丫IVI〕A )!1伍和大员表 达的融合压臼分别成联合免疫动物,以测定该分丁n化疫伙①’效爪。 乡uZ表明可 两牙。疫歹 均d 荆托功多 与刘照组相比多DM疫历丸重组蛋 白疫伯 及联 合疫市分爿砍六18.U%、22.*%和*.20旷fiU虫率以及 20.07%、34.55%和 49.55%的b成卵率,说明u-Rho GTPase DNA IR苗 及市11蛋 E]疫苗N“诱导小鼠产生一定的免疫保护作川,DNA )R苗初RI【l -亚组蛋白疫苗加强的联合免疫方案保护效果哭好于单一疫苗。 (三)11 小叮led吸虫附;**厂;;***八疫 茁及工圭蛋臼疫 茹的 促书抖o11 *‘究 将Sj-RI们G*h驼DNA疫休及重组蛋白疫茁分别及联合免疫动物 后多5不问问们,,J、飞爿井伽-沽汐以E工SA法现定总抗体效价及工g 业纤多 初步株 i 厂木山吸虫。午呕I人1\;*爿Sj-*。*卜。se*A疫功及亚组蛋臼 疫俏的业疫促护机制。结贝发现:重组蛋白疫苗及联合疫苗诱导产生 的抗仲效价较高,DNA疫苗及联合疫苗诱导产生的抗体以k GZa为主, 主要诱生Till型细胞免疫应各,重组蛋白疫苗诱导产生的抗体以比GI 为主,主要诱生TIZ型体液兔疫应答。 二、日木血吸虫红织强白腑B及天冬酞硼洲A疫苗 囱进一步刃究 十一) 日爿刑_吸虫复合ON八疫方的组织表达及功疫促了 效议研 究 为了灿本主所闪拴*本上 吸虫火陆 株二价h汛疫砍S* *CST和 幻钴{引’才 免疫{l’效果,将“只昆* 小鼠分为5组,两个*照纵 们小卜~别于川 凹头肌泞为二划u欠水和空析粒W<1*二,三个实验织 n小鼠则问法分别注射 SjGST、S尸卜GST和 Sj32-GST,每卜 3 W免 疫1O,〕仇疫3沙,锐3次免疫后光14 d,均勾亢召W只小鼠, 以问 投妃疫》c法人桨SjC盯、Sj31和Sj3二在川肉组织卜上的表达, 儿余可只鼠在第 3次免;ic后第 30 d,经腰部感染 10剃毛蝴,42 d后 刊杀 且数#刁鼠成虫数禾吁克nl咧0数多一 豆 日二SA分晋 小鼠_互 沾。-I二山j 仇休。V火表叨,小鼠I1勾幻织能正常表达疫古*w寺异性蛋白质抗原 分于,nH 分析表刃,扔二次抡疫后小鼠山现特异性k 抗体。与 < 理U水组比较,三个实验组 M氏虫率分别为33.肌、33.狐及27.N% (AO.01),U 口率分别为 61.86%、74.88*及 68.87*(AO.001)。与 *GST 全 *,**-GST 和S*2-GST 组的 刁 口率分别为34.*% 11 (KO.001)、18.51%(HO.05)。说明mA疫苗能诱导小鼠产生一定 水平的抗日本1亿吸虫感染保护性作用,二价疫苗的保护效果要大于单 价疫了。 (二)日本血吸虫组织蛋白酶B加A疫苗的免疫保护效果研究 为了解免疫这径对DNA lie苗的影响,进一步验证二价疫苗的效 果,将48只6~8周龄BALB八鼠随机分为4组,每组12只,对照组 u组)肌肉注射纯化的空白质粒载体VR1012,实验组①组)皮下


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