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鼻咽癌组织cDNA文库的构建及抗原基因的筛选

舒峻  
【摘要】: 目的:快速构建人鼻咽癌组织cDNA文库,以SEREX方法从cDNA文库中筛选鼻咽癌抗原基因。 方法:采用初诊鼻咽癌患者新鲜活检组织,抽提总RNA,以含有SfiIB酶切位点的oligo(dT)引物合成第一链cDNA,同时利用SMART(Switching Mechanism at 5' end of RNA Transcript)技术以含SfiIA酶切位点的SMART寡核苷酸为引物经LD-PCR扩增双链cDNA,双链cDNA经SfiI(IAIB)酶切后,以CHROMA SPIN-400柱分级分离cDNA,收集符合需要的cDNA片段并纯化,随后将之与入TripIEx2载体连接,经体外包装成噬菌体cDNA文库。测定原始文库滴度,进行蓝白筛选以确定文库的重组率,并随机挑取克隆经PCR扩增鉴定插入片段大小。抽取同一患者自身的外周静脉血分离血清,经预吸收细菌XL1-Blue裂解物处理后,“一对一” 地血清学筛选所构建的鼻咽癌组织cDNA表达文库,阳性克隆经PCR检测鉴定后进行序列分析。 结果:经测定原始文库滴度为7.28×10~6pfu/ml,含3.64×10~6个重组子,重组率为94%,扩增文库滴度为3.8×10~9pfu/ml,cDNA插入片段大小在0.5~3.0kb之间,平均为1.2kb。文库经三轮血清学筛选共获得23个阳性克隆,经PCR扩增后进行测序分析及与相关数据库比对,分别代表了16个独立的cDNA插入片段(抗原基因)。其中10个与已知基因高度同源,另外6个基因与GenBank中已知基因的部分同源,其中有3个可能是新基因。 结论:利用SMART技术构建的人鼻咽癌组织cDNA表达文库,文库质量较高,有利于以cDNA文库为基础的进一步的实验研究。应用 硕士学位论文 摘要. S朋以技术初步筛选鼻咽癌组织CDM文库,共得到16个鼻咽癌相关 ~ 抗原基因,其中有3个可能是新基因,它们与鼻咽癌的相关性有待于 进一步的研究证实卜


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