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全血基因组DNA的快速提取及其应用

罗心静  
【摘要】: 目的:建立简便、快速、可靠的分离纯化全血中基因组DNA的方法,以便能在普通的临床实验室使用和推广。 方法:采用不完全溶血剂STMT处理全血样品,异硫氰酸胍裂解白细胞核,硅胶特异性吸附释放出来的DNA,漂洗液洗去硅胶上非DNA成分,最后用TE把DNA从硅胶上洗脱下来。对所建立的方法的实验条件包括异硫氰酸胍(GuSCN)浓度、结合液pH值、结合温度等进行优化,从而得到高质量的DNA溶液,建立异硫氰酸胍-硅胶法。并对所建立的方法通过以下几方面进行评价,包括DNA的产量、DNA的纯度、DNA的完整性、RNA的污染、重复性,以及将纯化产物应用于PCR反应和限制性内切酶消化,并与传统的SDS-蛋白酶K/苯酚-氯仿(简称酚-仿)法进行比较。 结果: 1、异硫氰酸胍(GuSCN)浓度、结合液pH值和结合温度等影响异硫氰酸胍-硅胶法的提取效率。其最佳条件是GuSCN浓度为4M、结合液pH值为6.5、结合温度为37℃。 2、异硫氰酸胍-硅胶法提取DNA平均含量(3.7μg/100μl全血)高于酚-仿法(2.99μg/100μl全血)(p<0.05),纯度(OD260/OD280 1.78)与酚-仿法(OD260/OD280 1.76)无显著差异(p>0.05);RNA污染试验表明,该方法提取的DNA基本上无RNA污染;琼脂糖凝胶电泳结果显示,该方法提取的DNA为大分子物质,在紫外吸收有典型的DNA紫外吸收峰。 3、该方法重复性好,提取DNA的产量批内变异系数为6.02%,纯度批内变异系数为6.74%。 4、提取DNA适合于限制性酶切反应,PCR反应等。 结论: 1、建立简单、快速提取全血基因组DNA的异硫氰酸胍-硅胶法,整个提取过程费时小于40min。 2、提取的DNA质量高、纯度好,适用于大多数分子生物学实验,如PCR、限制性酶切反应等。 3、费用低,无需贵重试剂和特殊仪器,易于临床实验室大规模使用。


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