视网膜内Kir通道的分布、表达和发育

【摘要】：目的：本研究在mRNA和蛋白水平探讨在牛视网膜内Müller细胞的Kir2.1和Kir4.1的表达和分布及其功能，Kir7.1在牛视网膜色素上皮细胞(RPE)的表达和分布；同时研究三种Kir通道在不同种属大鼠、猴和人的视网膜的分布及在大鼠视网膜中发育情况。 方法：从牛神经视网膜和视网膜色素上皮分离mRNA，用RT-PCR，和Northern Blot斑点杂交分析不同亚型Kir2.1、Kir4.1和Kir7.1在牛神经视网膜和RPE的mRNA的表达；从牛神经视网膜和视网膜色素上皮分离蛋白质，用Western Blot斑点杂交分析检测不同亚型Kir蛋白Kir2.1、Kir4.1和Kir7.1在牛神经视网膜和RPE的分布；用间接免疫荧光组织化学和ABC法免疫组织化学在冰冻切片上检测三种Kir蛋白在牛、大鼠、猴和人视网膜中的定位及在不同年龄大鼠视网膜中的发育情况。 结果：RT-PCR结果显示Kir2.1 cDNA产物在神经视网膜中强表达，在RPE中弱表达；Kir4.1 cDNA产物仅在神经视网膜中表达，RPE内无表达；Kir7.1 cDNA产物在RPE中强表达，在牛神经视网膜弱表达。Northern斑点杂交分析显示Kir2.1 cDNA探针杂交在牛神经视网膜中检测到6.5KB大小的带，Kir4.1 cDNA探针杂交在神经视网膜中检测到5.5KB大小的带，两者均在RPE中均无表达；Kir7.1 cDNA探针杂交在牛神经视网膜和RPE中均得到大约1.5KB的带，且RPE中的mRNA表达量显著多于神经视网膜。Western斑点杂交在牛神经视网膜中得到约60 Kda单体的Kir2.1和约60 Kda单体的Kir4.1；在 RPE仅检测约53Kda单体的Kir7.1，这些蛋白都能被相应产生抗体的 多肤所抑制。间接免疫荧光组织化学显示，Kir2.1蛋白主要分布在M uller细胞与神经元相接触的细胞膜区域;与Muller细胞的特异性标 记蛋白质抗谷氨酸合成酶抗体(GS)双重标记显示其分布特性重叠， 在RPE未检测K 1 r2.1蛋白的免疫活性存在;Kir4.1蛋白集中分布于 Muller细胞的内侧突起，与GS蛋白双重标记显示其分布特性重叠， RPE未检测Kir4.l蛋白的免疫活性存在;Kir7.1主要分布于RPE游 离面及其突起的全长，与特异性标记RPE突起的Ezrin蛋白完全重 叠，Na+一K+ATP酶在不同部位的RPE表达不同，Na+一K+AfP高表 达的RPE细胞与Kir7.1的分布特性重叠。ABC免疫组织化学显示 Kir2.1和Kir4.1分布在猴和人视网膜M沮ler细胞的不同部位，而 Kir7.1分布于人和猴的RPE细胞的游离面及其突起。在不同年龄的大 鼠中，KirZ.l和Kir4.1均在P，6表达接近成年水平，Kir7.l在P:表达 接近成年水平。 结论:这些结果显示，KirZ .1和Kir4.1在P16接近成年水平，分 布于视网膜Mulle:细胞的不同部位，在不同种类之间无明显差别， 这种分布特性可能与完成Muller细胞功能一保持细胞外K+的平衡， 促进K+的内流有重要关系。Kir7.1在P7表达接近成年水平，分布于 RPE的游离面和突起的全长，在不同种类之间无明显差别，说明Kir7.1 的特性可能促进K+的转运和光引起的视网膜下间隙K+浓度的RPE 电反应相关。