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拳卷地钱中黄酮类化合物的分离纯化、结构表征及生物活性研究

朱华  
【摘要】:论文在整理大量文献、调查药材资源的基础上,以苔藓植物地钱中药用活性成分为目标,对广西产拳卷地钱(Marchantia convoluta Gaoet chang)进行了生药鉴别及化学成分的分析、提取、纯化、分离与生物活性研究,从苔藓植物拳卷地钱中提取分离了一类具有明显生物活性的成分—黄酮类化合物。系统地研究了拳卷地钱中黄酮类化合物的提取、纯化、分离的工艺条件,所得到的黄酮类化合物单体通过HPLC、UV、IR、HNMR、MS、HPLC-MS等仪器手段进行定性、定量分析,确定了其结构,并提出了固相萃取法分离黄酮类化合物的模型。生物活性实验研究发现拳卷地钱总黄酮具有明显的抗乙型肝炎病毒、保护肝功能、抑菌、抗炎、利尿等作用,在此基础上进行了拳卷地钱总黄酮注射液的研制。为开发拳卷地钱新药提供了实验依据与基础。具体内容摘要如下: 1.样品调查及鉴别。根据产地调查、标本采集和生药鉴定,查明广西境内3种地钱属植物,分别是地钱Marchantia polymorpha、拳卷地钱Marchantia convoluta以及粗裂地钱Marchantia paleacea,以拳卷地钱为主。在原植物形态、药材性状、显微构造、理化鉴定和紫外光谱、指纹图谱方面进行了研究,并提出了上述3种地钱的鉴别方法。通过系统预试验初步查明拳卷地钱所含化学成分类型,应用GC-MS技术分析其挥发油中成分,通过硅胶柱层析分离其脂溶性部位得到β-谷甾醇和豆甾醇2个植物甾醇成分。 2.黄酮类化合物的含量测定。采用改进的铝盐显色可见分光光度法测定地钱中总黄酮含量,研究了最大吸收波长、显色剂的加入量、显色时间等条件对拳卷地钱总黄酮含量测定的影响,得到最佳测定条件:NaNO_2-AlCl_3为显色剂,显色时间15 min之内,测定波长525nm,拳卷地钱总黄酮含量与吸光度符合校准曲线Y=-0.0153+0.03003X,加标回收率在97.61%~101.59%之间,平均加标回收率达99.28%,精密度高(RSD=1.1%,n=5)。该法操作简便、快速,数据可靠,可以作为拳卷地钱总黄酮含量的测定方法。 3.总黄酮提取。采用正交试验,研究了温度、乙醇浓度、提取时间、料液比和提取次数对拳卷地钱中总黄酮的提取率的影响,得到拳卷地钱中总黄酮的最佳提取条件:温度为70℃,时间0.5小时,提取次数3次,提取溶剂为80%的乙醇,料液比为1:15,提取率达1.90%。并将酶解法用于地钱总黄酮的提取,得到最佳提取条件:当地钱用量为1g/20mL H_2O 时,提取介质中酶一1浓度为0.2mg/mL,酶解温度50℃,pH二4.5,酶解 时间120min,总黄酮浸出率达1.96%。酶解法提取拳卷地钱总黄酮不用 有机溶剂,节约成本;反应温度低,降低了生产能耗。 4.黄酮类化合物单体的分离鉴定。采用固相萃取法分离制备黄酮类 化合物的单体,高效液相色谱法跟踪测定纯度,理化方法结合UV、IR、 HNMR、MS、HPLC一MS等仪器手段进行结构表征,从拳卷地钱中分离鉴 定得到三个单体,分别为5一经基一7一甲氧基一2一甲基色原酮(I)、7一轻基黄 酮(lI)和芹菜素一7一O一p一D一葡萄糖醛酸贰(m),以上单体均为首次从 广西产拳卷地钱中分离得到;以芹菜素为例,建立了固相萃取法分离黄 酮类化合物的模型,从固相萃取填料的选择、萃取溶剂的选择、萃取溶 剂的比例、上柱方式、洗脱方式等方面进行了探讨,得到了最佳分离条 件,探讨了固相萃取分离黄酮类化合物的共性问题。 5.黄酮类化合物HPLC分析。建立了反相高效液相色谱法测定拳卷 地钱黄酮类化合物含量的方法:以乙酸一甲醇一乙睛一磷酸一水为多元混合 流动相,等度洗脱,在30 min内对地钱的黄酮提取物直接进行分离与测 定,检测波长为350nm,流速0.60 mL/min,采用校准曲线法对实际样品 中的芹菜素、棚皮素和木犀草素进行定量分析。实验结果表明:本方法平 均加标回收率%.79一101.13%,相对标准偏差0.“%一1.52%。该法可用 于拳卷地钱黄酮提取物的精确分析。 6.总黄酮的生物活性实验研究。在抗乙肝病毒体外实验中,拳卷地 钱总黄酮在5种不同药物浓度时对朋sAg和HBeAg均有明显抑制作用。 拳卷地钱总黄酮高剂量组和联苯双酷组能显著降低CCI;所致急性肝损伤 小鼠血清中ALT、AST活性,并能升高TP和ALB含量。拳卷地钱总黄 酮对大肠杆菌、伤寒杆菌、金黄色葡萄球菌、肠炎杆菌、乙型溶血性链 球菌、肺炎双球菌的最低抑制菌浓度(MIC)分别为2.50、0.625、0.625、 2.50、2.50、1 .25 mg/mL。拳卷地钱总黄酮高剂量组对二甲苯引起小鼠耳 郭肿胀具有明显的抑制作用。结果提示拳卷地钱总黄酮在体外实验和动 物模型中,具有明显的抗乙肝病毒,保肝降酶作用;并具有抗菌、抗炎作 用,以及对大鼠具有明显的利尿作用。 7.总黄酮抗乙肝病毒的体外细胞实验研究。通过研究发现:拳卷地 钱总黄酮对HBsAg和HBeAg具有很强的抑制作用,并抑制HBV一DNA复 制和表达。5抖留mL、10林g/mL、20“g/mL、40“g/mL的拳卷地钱总黄酮 用药3天后对HBsAg、HBeAg的抑制率分别是100林g八nL拉米夫定抑制 率的1.29倍、1.80倍、1.85倍、1.96倍和0.76倍、0.65倍、1.19倍、1.22 倍。拳卷地钱总黄酮的抑制抗原半数有效浓度IC50分别为35 .45林留mL、 28.77林g/mL、17.11林g/mL。高剂量拳卷地钱


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