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乳酸氧化酶的制备及其固定化催化DL-乳酸生产丙酮酸研究

周林  
【摘要】: 以耻垢分枝杆菌(Mycobacterium Smegmatis AS1.0562)为乳酸氧化酶(Lactate Oxidase,LOD)制备的菌种来源,对其产酶发酵条件、乳酸氧化酶提取工艺、酶学性质及其固定化催化DL-乳酸生产丙酮酸进行了系统的研究。主要研究内容和结果如下: 培养基中添加甘油3.0%,蛋白胨0.4%,DL-乳酸1.0%,维生素B_1 0.005%,KH_2PO_4·H_2O 0.05%,MgSO_4·7H_2O 0.05%,硫酸亚铁胺0.01%有助于产酶;优化发酵条件为:250mL三角瓶中装液量50mL,起始pH7.2,培养温度37℃,静置培养4d,乳酸氧化酶平均酶活为65.4U/mL。 采用均匀设计法优化了乳酸氧化酶提取工艺,超声波法的最佳工艺条件为:超声功率100W,超声时间8min,磷酸盐缓冲液pH 7.8;冻融法的最佳工艺条件为:冻融次数4次,解冻时间25min,解冻温度37℃,磷酸盐缓冲液pH7.4;在优化工艺条件下,超声波法提取效果要优于冻融法。 耻垢分枝杆菌经增菌诱导培养、超声波破碎、高速冷冻离心后获得乳酸氧化酶粗酶液,经30%~70%饱和度的硫酸铵分级沉淀及透析脱盐初步纯化后,对其酶学特性进行了研究,该酶的最适反应温度为37℃,反应温度高于65℃时酶蛋白基本上完全变性失活,55℃保温60min酶活保存40%;最适反应pH为7.4,在pH6.5~8.0范围内酶蛋白稳定;低浓度的Na~+和Mn~(2+)、Co~(2+)对该酶有激活作用,Ca~(2+)、Mg~(2+)、Zn~(2+)、Al~(3+)、Fe~(3+)、Cd~(2+)对该酶有抑制作用;表面活性剂十二烷基磺酸钠、吐温20、吐温60能增强酶蛋白的热稳定性;酶的动力学分析表明:以DL-乳酸为底物的Km=9.24×10~(-3)mol/L,Vmax=2.42μmol/(min.mg)。 采用海藻酸钠包埋、戊二醛交联方法固定化乳酸氧化酶,优化了固定化酶的制备条件,测试了部分酶学性质。1mL酶液和1mL 4%的海藻酸钠溶液混合后,用注射器滴入到20mL 0.2mol/L的GaGl_2溶液中,25℃静置固化2h后,过滤洗涤,转移到0.2%戊二醛溶液中25℃交联2h,再经过滤、洗涤和干燥得到球状固定化酶。经固定化后的酶,热稳定性得到显著提高,游离酶在65℃保温1h酶蛋白完全变性失活,而固定化酶在65℃保温1h仍可保持86%的酶活力;其最适酶促反应温度由37℃升至55℃,最适反应pH=7.4保持不变;在不加保护剂的条件下,4℃放置50d后游离酶仅保持40%以上的酶活力,固定化酶能保持80%以上的酶活力。该固定化乳酸氧化酶生物催化DL-乳酸生产丙酮酸,3h后丙酮酸产率可达75%,连续循环使用5个批次固定化酶活力仍保持有85%。


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