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不同造血微环境对诱导人胚胎干细胞向造血细胞分化的影响

赵海军  
【摘要】: 目的比较人卵黄囊基质细胞、人胎肝基质细胞和人胎骨髓基质细胞对诱导人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,hESC)向造血细胞分化效率的差别;采用蛋白质组学方法筛选鉴定人胎肝基质细胞和人胎骨髓基质细胞的差异蛋白,探讨不同基质细胞诱导人胚胎干细胞向造血细胞分化效率差别的可能机制。 材料和方法诱导使用的人胚胎干细胞株为我所建系的细胞株,并在诱导前检测其造血特异抗原(KDR,CD34,CD45)表达水平。在中南大学伦理委员会指导下,病人获得知情同意后,获取4-6周妊囊,从卵黄囊中分离基质细胞;获取4-6月水囊引产的胚胎,分离胎肝和骨髓基质细胞。实验前检测三种基质细胞造血特异抗原(KDR,CD34,CD45)表达水平。 先将人胚胎干细胞自发分化形成5天的拟胚体(embryonic bodies,EBs),再用三种不同的基质细胞作为饲养层细胞,通过其与5天的EB直接接触共培养10天,比较不同基质细胞对诱导人胚胎干细胞向造血细胞分化效率的差别。通过胎肝基质细胞与5天EB非直接接触共培养,观察胎肝基质细胞直接接触与非直接接触对5天EB向造血细胞分化效率的差别。 采用双向凝胶电泳技术建立人胎肝基质细胞和人胎骨髓基质细胞蛋白图谱。经软件分析筛选两者之间的差异蛋白点,通过质谱技术鉴定部分差异蛋白点。 结果 1.诱导使用的三种基质细胞均采用第三代细胞,呈梭形。卵黄囊基质细胞和骨髓基质细胞不表达KDR、CD34、CD45;胎肝基质细胞不表达KDR,CD34和CD45的表达百分率分别为0.30±0.01%、0.20±0.01%。 2.诱导前的hES不表达KDR、CD34、CD45;自发分化形成的5d EB表达KDR、CD34、CD45百分率分别为1.10±0.01%、0.30±0.01%、0.20±0.02%。不同基质细胞诱导5天EB向造血分化结果如下:①5天EB与卵黄囊基质细胞直接接触培养10天生成的细胞表达KDR、CD34、CD45百分率分别1.80±0.56%、1.30±0.14%、1.05±0.63%;②5天EB与胎肝基质细胞直接接触培养10天生成的细胞表达为KDR、CD34、CD45百分率分别为34.0±25.45%、38.4±24.8%、72.6±25.7%;③5天EB与胎肝基质细胞非直接接触培养10天生成的细胞表达KDR、CD34、CD45百分率分别为0.20±0.10%、0.37±0.20%、0.27±0.14%;④5天EB与骨髓基质细胞直接接触培养10天生成的细胞表达KDR、CD34、CD45百分率分别为2.50±1.48%、3.20±0.56%、1.65±0.21%;⑤5天EB自发分化10天生成的细胞表达KDR、CD34、CD45百分率分别为0.30±0.07%、0.65±0.07%、0.15±0.07%。与自发分化10天比较,三种基质细胞与5天EB直接接触,均能够促进EB向造血细胞的分化,且胎肝基质细胞诱导的效率显著优于其它两种基质细胞(P<0.05);胎肝基质细胞与5天EB直接接触培养效率明显优于非直接接触培养(P<0.05)。 3.采用双向凝胶电泳技术建立人胎肝基质细胞和人胎骨髓基质细胞的总蛋白图谱。经PDQUEST软件分析,筛选出在人胎肝基质细胞有表达而人胎骨髓基质细胞不表达的蛋白点30个;两种基质细胞之间蛋白表达量相差在10倍以上的蛋白点13个; 4.分析得到的差异蛋白点经MALDI-TOF-TOF-MS鉴定出26个,其中在胎肝基质细胞中高表达的蛋白包括与细胞收缩、黏附相关的蛋白和造血发生相关信号传导通路的蛋白。 结论(1)与卵黄囊基质细胞和骨髓基质细胞比较,胎肝基质细胞更有利于诱导人胚胎干细胞向造血细胞的分化;胎肝基质细胞与5天EB直接接触培养优于非直接接触培养。(2)分析鉴定出入胎肝基质细胞和人胎骨髓基质细胞之间的26个差异蛋白点。其中,在人胎肝基质细胞中高表达的蛋白包括细胞收缩、黏附等相关的成分以及造血发生相关信号传导通路的蛋白。


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