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Arkadia-Smad7介导TGF-β信号通路的正向调控与肾纤维化的关系

李晓照  
【摘要】: 研究背景TGF-β_1在肾小管间质纤维化的发病机制中起到重要的作用,具体过程可能与其诱导肾小管上皮细胞转分化有关。TGF-β_1的生物学效应是通过其激活的信号转导通路介导得以实现,而Smads蛋白对TGF-β信号转导通路激活状态的维持至关重要。Smad7能够与R-Smad(Smad2、Smad3)竞争性地与被激活的TGF-β受体结合从而阻止Smad2、Smad3与TGF-β受体结合及其随后的磷酸化过程,最终导致TGF-β/Smad信号转导通路的生物学效应被抑制(减弱)。研究表明,在多种组织、器官纤维化发生过程中,病变组织及细胞中Smad7蛋白表达明显低于正常对照组;而上调Smad7蛋白的表达则能够减轻或逆转纤维化。可见,在纤维化的发生过程中,Smad7对Smads介导的TGF-β信号通路的调节起到关键作用。研究显示,泛素-蛋白酶体通路通过对Smads的降解而达到调节TGF-β信号转导通路的生物学效应。在上述过程中,E3泛素连接酶(如Arkadia和Smurfs)的参与作用十分重要。同时研究表明,Smad7能够将E3泛素连接酶招募至TGF-β受体,之后与他们发生相互作用最终E3泛素连接酶通过蛋白酶体将TGF-β受体及Smad7降解。有学者利用UUO大鼠模型对Smurfs和Smad7在肾纤维化过程中的作用机制进行了相关研究,结果发现,在TGF-β/Smad信号通路的生物学效应上调的同时,伴随有Smad7 mRNA表达的上调及Smad7蛋白表达水平的显著下降,而且表明Smad7的下调是由于泛素蛋白酶体通路的降解作用所致。由此似乎可以推论Smurfs通过介导Smad7的降解能够放大(增强)TGF-β信号转导通路的生物学效应。然而,该研究仅仅就Smurfs和Smad7的关系进行了探讨,而对TGF-βI型受体(TβRI)在UUO大鼠肾脏组织中的表达情况以及TβRI与Smurfs之间的相互作用关系并未涉及。此外,其他的E3泛素连接酶在肾纤维化中对Smad7蛋白的作用仍然需要阐明。另有研究表明,Smurfs通过与Smad7的结合降解TGF-β受体导致TGF-β信号通路的减弱,这与上述推论(Smurfs通过降解Smad7能够放大TGF-β信号转导通路在肾纤维化发病机制中的生物学效应)似乎存在矛盾。与Smurfs有所不同,另一E3泛素连接酶Arkadia对TGF-β受体并无降解作用,它可以直接降解Smad7从而达到放大TGF-β信号转导通路生物学效应的作用。鉴于Arkadia介导Smad7的降解作用具有相对特异性,探讨二者在肾小管间质纤维化以及与此密切关联的肾小管上皮细胞转分化过程中的相互作用及其机制对肾纤维化的防治具有一定的理论意义。 第一章Arkadia-Smad7介导TGF-β信号通路的正向调控与肾小管间质纤维化的关系 目的利用UUO大鼠模型,初步探讨肾小管间质纤维化过程中Arkadia、Smurf2、Smad7及TβRI等信号分子在TGF-β/Smad信号转导通路中相互作用关系及其表达变化。 方法SD大鼠随机分为模型组和假手术组(sham组),模型组每组6只:UUO术后3天组、UUO术后7天组、UUO术后14天组及UUO术后28天组;假手术组每组4只。采用单侧(左)输尿管结扎方法,建立梗阻性肾小管间质纤维化大鼠模型,Sham组只游离输尿管而不结扎。分别于术后3天、7天、14天、28天处死动物,取结扎侧肾脏;同时处死假手术组大鼠,取出肾组织。观察各组间肾脏病理学变化,采用免疫组化、Western-blot、RT-PCR及免疫共沉淀等方法检测Arkadia、Smurfs与Smad7、TβRI等表达变化及其相互作用关系。 结果光镜下假手术组大鼠肾组织无明显变化,模型组大鼠随着输尿管结扎时间的延长,其肾组织逐渐出现肾小管进行性扩张、弥漫性炎症细胞浸润,间质面积增宽、部分肾小管萎缩、肾小管上皮细胞空泡样变性,最终出现肾小管结构遭到严重破坏,代之以浸润的炎性细胞和弥漫增生的纤维组织。 与假手术组相比,RT-PCR显示模型组大鼠肾组织中Col-1 mRNA及TGF-β1 mRNA的表达随梗阻时间延长而逐渐增强;与假手术组相比,Western Blot及RT-PCR均显示模型组大鼠肾组织中Arkadia及其mRNA表达逐渐增强;与假手术组相比,RT-PCR显示模型组大鼠肾组织中Smad7 mRNA表达逐渐增强,而免疫组化及Western Blot则显示模型组大鼠肾组织中Smad7蛋白质表达逐渐较弱;与假手术组相比,Western Blot显示模型组大鼠肾组织中Smurf2、TβRI蛋白质表达逐渐增强。 免疫共沉淀显示,用Smad7抗体沉淀后,用相应的抗体行WresternBlot检测显示Arkadia-Smad7复合物、Smurf2-Smad7复合物及TβRI-Smad7复合物在模型组及假手术组大鼠肾组织中均有表达。用TβRI抗体沉淀后,用相应的抗体行Western Blot检测显示Arkadia-TβRI复合物在模型组及假手术组大鼠肾组织中均无表达;Smurf2-TβRI复合物、Smad7-TβRI复合物在模型组及假手术组大鼠肾组织中均有表达。 结论Arkadia-Smad7介导TGF-β信号通路的正向调控在一定程度上促进了肾小管间质纤维化的发生发展。 第二章Arkadia-Smad7介导TGF-β信号通路的正向调控与肾小管上皮细胞转分化的关系 目的通过观察Arkadia-siRNA及蛋白酶体抑制剂(Lactacystin)对Smad7的影响及由此所致的TGF-β_1诱导肾小管上皮细胞转分化过程变化,借以探讨Arkadia和Smad7在肾小管上皮细胞转分化过程中相互作用及其基本机制。 方法常规培养正常人肾小管上皮细胞(HKC),用TGF-β_1对HKC细胞进行刺激,在此过程中分别用Arkadia-siRNA、Smurf2-siRNA及Lactacystin对HKC细胞进行预处理。采用Westem-blot、RT-PCR、免疫细胞化学及免疫共沉淀方法分别检测Arkadia、Smurfs与Smad7、TβRI等信号分子及肾小管上皮细胞转分化代表性物质(α-SMA、E-cadherin)及Col-I在HKC细胞中的表达变化及其相互作用关系。 结果与对照HKC相比,RT-PCR和Western Blot均显示,TGF-β_1干预能够使Arkadia及其mRNA在HKC中表达上调;与对照HKC相比,RT-PCR显示,TGF-β_1干预能够使Smad7 mRNA在HKC中表达上调,而Western Blot则显示,TGF-β_1干预能够使Smad7蛋白在HKC中表达下调;与对照HKC相比,Western Blot均显示,TGF-β_1干预能够使Smurf2及TβRI蛋白质在HKC中表达上调。 免疫共沉淀显示,用Smad7抗体沉淀后,用相应抗体行Western Blot检测显示,Arkadia-Smad7复合物、Smurf2-Smad7复合物及TβRI-Smad7复合物在TGF-β_1刺激HKC及未刺激HKC中均有表达。用TβRI抗体沉淀后,用相应抗体行Western Blot检测显示,Arkadia-TβRI复合物在刺激组及对照组HKC中均无表达;Smurf2-TβRI复合物及Smad7-TβRI复合物在刺激组及对照组HKC中均有表达。 RT-PCR和Western Blot均显示,Arkadia-siRNA能够显著抑制TGF-β_1对Arkadia的诱导表达作用。与TGF-β_1刺激HKC组相比,RT-PCR显示,Arkadia-siRNA及Lactacystin对TGF-β_1诱导Smad7 mRNA的减少无明显影响;Western Blot及免疫细胞化学显示,Arkadia-siRNA及Lactacystin均可部分上调TGF-β_1对Smad7蛋白表达的减少作用。与TGF-β_1刺激HKC组相比,Western Blot显示,Smurf2-siRNA及Lactacystin的干预均能使TGF-β_1对HKC中Smurf2蛋白的诱导作用受到抑制;Lactacystin能够上调TGF-β_1对Smad7蛋白的减少作用,而Smurf2-siRNA则无此作用。Western Blot显示,Lactacystin能够下调TGF-β_1对HKC中TβRI蛋白的诱导作用,而Arkadia-siRNA则对HKC中TβRI蛋白表达无明显影响。 RT-PCR和Western Blot均显示,TGF-β_1干预能够使HKC中Col-1及其mRNA、α-SMA及其mRNA的表达逐渐上调,使E-cadherin及其mRNA的表达减弱,Arkadia-siRNA及Lactacystin则能够部分逆转TGF-β_1的上述生物学效应。 结论Arkadia-Smad7介导TGF-β/Smad信号通路的正向调控对肾小管上皮细胞转分化的发生可能起到一定促进作用。


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