纳米细菌对人胆囊结石形成的影响和机制探讨

【摘要】： 目的：通过对胆囊结石中纳米细菌和大肠杆菌的分别培养与鉴定，以及对两菌混合培养后在不同培养条件下的生长状况，菌液涂片的茜素红钙染色情况的分析，及培养上清中的β-葡萄糖醛酸酶的定量分析，以期发现纳米细菌和大肠杆菌在胆囊患者体内共同存在、相互作用、协同促进结石形成的证据。 方法：取45例胆囊结石患者的结石标本，每例标本分成两份，任取一份结石标本进行纳米细菌培养，光镜观察纳米细菌的生长情况，并对培养物采用纳米细菌单克隆抗体免疫荧光染色、茜素红钙染色、及电镜下寻找纳米细菌的形态学证据，判断纳米细菌在标本中感染状况；取另一份胆囊结石患者的结石标本，进行大肠杆菌的培养与鉴定，判断大肠杆菌在标本中的感染状况；计算45例胆囊结石患者的结石标本中纳米细菌和大肠杆菌的感染率，并对其进行Kappa一致性检验，寻找两者在胆囊结石形成过程中共生关系的证据；进行纳米细菌和大肠杆菌混合培养，对培养物采用茜素红钙染色及β-葡萄糖醛酸酶的测定，探讨纳米细菌与大肠杆菌的相互作用以及其机制。 结果：对45例结石标本的培养物进行免疫荧光染色，显微镜观察其中有18例感染纳米细菌，阳性率为40％；采用茜素红钙染色，发现其中有21例感染纳米细菌，阳性率为46.7％。胆囊结石患者的45例结石标本中有24例感染大肠杆菌，阳性率为53.3％。胆囊结石患者的45例结石标本中有16例的培养物，纳米细菌和大肠杆菌检测都为阳性，Kappa一致性检验说明两者共感染一致率高(P＜0.01)。纳米细菌与大肠杆菌混合培养后，培养瓶中出现白色钙化样物质，菌液在琼脂板上传代培养后发现混合培养菌落周围有白色粉末颗粒，混合培养菌液涂片发现部分大肠杆菌茜素红钙染色呈阳性(30％±2％)，高于大肠杆菌单独培养组(P＜0.01)；纳米细菌与大肠杆菌混合培养后检测未发现大肠杆菌的β-葡萄糖醛酸酶分泌增加(P＞0.05)。 结论：胆囊结石患者的结石中存在着纳米细菌感染；胆囊结石患者的结石中存在着大肠杆菌感染；纳米细菌与大肠杆菌在胆囊结石中的共感染一致率高，可能共同参与胆囊结石的形成；免疫荧光试验和透射电镜可以帮助鉴定纳米细菌；短时间的混合培养后，纳米细菌通过直接附着和侵入大肠杆菌的方式引起大肠杆菌发生生物矿化作用；尚没有证据支持纳米细菌是通过促进大肠杆菌产生β-葡萄糖醛酸酶这条途径增强其促成石能力。 目的：在成功分离、培养人胆囊上皮细胞的基础上，研究纳米细菌对人胆囊上皮细胞的侵袭作用。 方法：寻找适宜的方法和合适的体外生长条件，行体外分离、培养及鉴定人胆囊上皮细胞。然后将实验分为两组，第一组将纳米细菌菌株Se90和人胆囊上皮细胞爬片混合培养，第二组为胆囊上皮细胞爬片空白对照组。光镜下观察不同浓度纳米细菌攻击后人胆囊上皮细胞的形态学变化；使用四唑盐(MTT)比色试验检测被攻击后细胞的存活和生长情况；使用免疫荧光染色观察不同时间点纳米细菌于上皮细胞的空间位置关系；透射电镜下观察被纳米细菌攻击后的胆囊上皮细胞超微结构的改变。 结果：使用钝性刮擦法，置于含20％胎牛血清的DMEM培养基在37℃、5％CO_2、饱和湿度的二氧化碳培养箱内，成功地进行了人胆囊上皮细胞的分离和体外原代培养，并理想贴壁，制作了细胞爬片。纳米细菌菌株Se90与人胆囊上皮细胞爬片混合培养后，光镜下观察不同浓度纳米细菌侵袭细胞爬片后的情况。随着时间推移，被攻击的胆囊上皮细胞逐渐出现水肿，分离，随后细胞破碎，胞核溶解消失，此过程中未发现明显凋亡小体形成。将纳米细菌和胆囊上皮细胞爬片混合培养，检测不同时间含不同浓度纳米细菌混合培养液的上清液中四唑盐(MTT)的值，比较48和72、小时MMT结果，稍高浓度组(OD=0.02)吸光度值均明显低于低浓度组的吸光度值(P＜0.01)；在72小时低浓度组(OD=0.005)比对照组吸光度低，比较差异具有显著性(P＜0.01)，而在48小时该组与对照组比较，差异无显著性。免疫荧光染色显示，纳米细菌可以在较短时间内进入胆囊上皮细胞中，且随着时间的推移，进入胆囊上皮细胞内的细菌逐渐增多，直至进入汇集于胞核。在电镜下观察细胞超微结构发现，胆囊上皮细胞受到纳米细菌攻击以后，细胞表面丰富的微绒毛减少，细胞内线粒体肿胀明显，严重情况下细菌侵入细胞内部，造成细胞破裂坏死。 结论：适宜的方法和条件能有效进行胆囊上皮细胞的体外原代培养；纳米细菌可以在短时间内迅速进入胆囊上皮细胞并对其产生损伤作用，产生从大体形态到超微结构的一系列改变；且细菌浓度越高，作用时间越长，造成的损伤越严重；较短时间内(48小时内)被攻击的胆囊上皮细胞大部分的死亡方式是坏死而不是凋亡。 目的：从自由基以及细胞炎性因子的角度初步探讨纳米细菌对人胆囊上皮细胞的损伤机制。 方法：0.5 Mcfarland浓度纳米细菌攻击人胆囊上皮细胞以后，分别于不同时间点吸取培养上清液，按照试剂盒说明，采用酶联免疫吸附试验(ELISA)或RT-PCR方法，进行LDH，MDA，IL-1β，IL-6的含量检测。 结果：检测结果显示纳米细菌攻击胆囊上皮细胞以后，随着攻击的时间延长，LDH活性逐渐升高，72小时内各组比较差异具有显著性(P＜0.01)；同时各时间点MDA含量差异除了24小时组与对照组比较差异稍有显著性，其余各组之间差异无显著性(P＞0.05)；随着时间延长，IL-6的表达逐渐增高，至24小时达到高峰，72小时内实验组与对照组各时点间比较差异具有显著性(P＜0.01)；随攻击时间延长，IL-1βmRNA的表达量逐渐升高，1个小时(0.35±0.03)，6个小时(0.68±50.06)，12个小时(0.91±0.04)，24小时(1.14±0.07)实验组内各个时点之间比较有明显差异(P＜0.01)，而对照组的胆囊上皮细胞IL-1βmRNA未见明显表达，两组各时点间比较差异具有显著性(P＜0.01)。 结论：纳米细菌株Se90攻击人胆囊上皮细胞，能产生大量的IL-1β，IL-6等细胞因子，直接或者间接地导致细胞损伤。在损伤过程中可能没有自由基的参与而与大量的细胞炎性因子的分泌激活有关系。