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紫杉醇对人宫颈癌细胞系HCE_1影响的蛋白质组学研究

曹兰琴  
【摘要】: 目的:比较紫杉醇处理前后宫颈癌细胞系HCE_1蛋白表达谱的差异,对差异蛋白质点进行鉴定,从而揭示紫杉醇治疗宫颈癌的作用机制,从中筛选出评价紫杉醇疗效的特异蛋白质和找出新药治疗的靶点。 方法:本研究首先用紫杉醇干预人宫颈癌HCE_1细胞,采用MTT比色法检测紫杉醇对宫颈癌细胞增殖的影响,确定紫杉醇对宫颈癌细胞增殖抑制的最佳浓度;通过流式细胞仪分析紫杉醇处理后宫颈癌细胞凋亡和细胞周期的改变,进一步确定紫杉醇抑制宫颈癌细胞的最佳浓度和时间。然后提取紫杉醇最佳浓度、最佳时间作用下宫颈癌HCE_1细胞株和对照组的总蛋白质,利用固相pH梯度(Immobilized pH gradient,IPG)双向凝胶电泳(Two-dimensional electrophoresis,2-DE)分离处理组和对照组的总蛋白质,经考马斯亮蓝染色,图像扫描,获取处理组和对照组总蛋白质的双向凝胶电泳图谱。使用PDQuest软件对处理组和对照组的2-DE图谱进行分析比较,找出差异蛋白质点。应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)进行鉴定,获得蛋白质点的肽质量指纹图谱(Peptide mass fingerprint,PMF)。运用Mascot Distiller软件进行识别,搜索SWISS-PROT和NCBI蛋白质数据库,如果Mascot分数)64分(P<0.05)则认为得到鉴定,否则认为未得到结果。最后采用Westernblot技术对部分差异表达蛋白质进行验证。 结果:(1)紫杉醇对人宫颈癌HCE_1细胞的增殖具有抑制作用,且随着药物浓度的增加和作用时间的延长,抑制作用越明显。(2)流式细胞仪检测发现,低浓度(0.01μmol/L)紫杉醇只影响宫颈癌细胞的凋亡率,对细胞周期的影响不明显;高浓度(0.05μmol/L)紫杉醇对宫颈癌细胞的凋亡率及细胞周期均有影响,主要表现为处理组较对照组G_2期细胞明显增加,两者比较差异有显著性(P<0.05)。(3)通过MTT实验和流式细胞仪结果确定紫杉醇(0.05μmol/L)作用宫颈癌HCE_1细胞24小时对癌细胞增殖抑制作用及G_2期细胞影响最大,故选择0.05μmol/L紫杉醇干预HCE_1细胞24小时进行蛋白质组学分析。(4)蛋白质组学结果如下:①得到了分辨率较高、重复性较好的处理组和对照组的双向凝胶电泳图谱,处理组和对照组3块凝胶的平均蛋白质点数分别为912±18和879±25,平均匹配的点数分别为769±17和771±13,匹配率达84.5%和87.6%;处理组与对照组3块不同胶之间蛋白质点在等电聚焦(Isoelectric focusing,IEF)方向的偏差是1.322±0.228 mm,在十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)方向上的偏差为1.145±0.137mm。②比较分析处理组和对照组的双向凝胶电泳图谱,找到差异蛋白质点42个(差异蛋白点都是2倍以上差异且在三组中都有相同的差异),其中在处理组中表达上调的13个,在处理组中表达下调的17个,仅在处理组中表达的7个,仅在对照组中表达的5个。③选择表达量差异较明显的21个蛋白质斑点进行质谱分析,共有15个蛋白得到鉴定,其中8个蛋白在处理组表达上调,7个蛋白在处理组表达下调。④使用Western blot技术对角蛋白8及a-烯醇化酶进行验证,角蛋白8及a-烯醇化酶在处理组表达下调,与蛋白质组学的结果一致。 结论:①紫杉醇对宫颈癌细胞HCE_1的增殖具有抑制作用。②低浓度紫杉醇只影响宫颈癌细胞凋亡率;高浓度紫杉醇既影响宫颈癌细胞的凋亡率,又能改变细胞周期。③肽基脯氨酰顺反异构酶(PPIaseA)、α-烯醇化酶(α-enolase)、角蛋白8(keratin 8)、热休克蛋白90(HSP90)以及真核细胞翻译起始因子(eIF-1A)等蛋白可能参与紫杉醇对宫颈癌细胞HCE_1的抗瘤作用。


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