收藏本站
收藏 | 论文排版

乙型肝炎病毒L60V、I97L变异核壳蛋白对HepG2细胞HLA-A表达和细胞凋亡的影响

李发武  
【摘要】: 背景 HBV感染后的肝病表现有很宽的临床谱,包括无症状携带状态、急性自限性肝炎、慢性活动性肝炎以及暴发性肝炎等。HBV感染者免疫清除病毒的主要效应细胞为CD_8~+T细胞(CTL)、Th细胞和B细胞,其中CTL介导的细胞特异性免疫是主要途径,决定着感染者的临床结局。免疫因素并不能完全解释HBV感染者复杂的临床转归,HBV变异是另一个影响临床结局的重要因素。近年来,很多HBV变异株被分离和鉴定,并对其生物学特性进行了广泛而深入的研究。核壳蛋白是宿主细胞免疫的核心靶位,在病毒清除和病理损伤过程中起着重要作用,因此HBV/C区基因变异和氨基酸的改变格外引人关注。累计文献和资料,核壳蛋白常见的变异包括P5T、V13A、S35A、L59V、P68L、P130T和P135Q等,这些位点变异对肝细胞损伤无明显影响作用,主要见于无症状携带者,可能是不同地理环境病毒自然进化的结果;核壳蛋白L60V(AA60的亮氨酸被缬氨酸替代)和197L(AA97的异亮氨酸被亮氨酸替代)变异常见于活动性乙型肝炎,L60V、197L变异是否加重肝损伤及其作用机制尚不清楚。通过构建L60V、197L变异HBV全基因表达质粒,转染HepG2细胞,结果表明L60V、197L变异HBV株与野毒株HBV对细胞HLA-Ⅰ表达有不同影响作用;L60V、197L变异HBV全基因重组腺病毒载体注射到小鼠体内的研究表明,L60V、197L变异病毒株更容易免疫逃避。目前关于核壳蛋白功能研究尚少见。野毒株、L60V、197L变异核壳蛋白对细胞HLA-Ⅰ表达的影响作用尚不清楚。HBV全基因组对诱导的细胞凋亡有抵抗作用,但野毒株、L60V、197L变异核壳蛋白对诱导的细胞凋亡是否存在影响尚不清楚。 目的 研究野毒株核壳蛋白、L60V、197L变异核壳蛋白对HepG2细胞HLA-A表达的影响;研究野毒株核壳蛋白、L60V、197L变异核壳蛋白对诱导HepG2细胞凋亡的影响,通过细胞水平的研究以探讨C区热点变异核壳蛋白与野毒株可能存在的功能差异。 方法 [1]野毒株C区基因的获得:以P3.8Ⅱ为模板,PCR反应扩增野毒株核壳蛋白基因全长,两端带有EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点。扩增的PCR产物通过琼脂糖凝胶试剂盒回收纯化产物。将纯化的PCR产物与pMD18—T载体连接,转化DH5α克隆扩增,筛选阳性克隆,提取质粒pMD18—HBV/C区基因酶切鉴定。 [2]野毒株核壳蛋白表达载体pEGFP-WT的构建:将pEGFP-C1质粒转化扩增,EcaRⅠ和BamHⅠ双酶切,琼脂糖电泳后回收大片段;质粒pMD18—HBV/C区基因EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切,琼脂糖电泳后回收小片段。将酶切后的pEGFP-C1质粒与HBV/C区基因进行连接。连接产物转化DH5α克隆扩增,筛选阳性克隆,提取质粒,获得野毒株表达载体pEGFP-WT,酶切和测序鉴定。 [3]pEGFP-L97和pEGFP-V60重组载体的获得:通过Quick Change试剂盒在pEGFP-WT的基础上采用特异性引物进行定点突变,PCR反应产物DpnI酶切,转化XL2-Blue超级感受态细胞,铺板挑取突变克隆,筛出新合成的含突变子链的重组载体,酶切测序鉴定。 [4]重组载体的转染:用Lipofectamine 2000~(TM)将pEGFP-C1、pEGFP-WT、pEGFP-V60和pEGFP-L97转染HepG2细胞,6小时后更换为无抗生素的含10%小牛血清的DMEM培养液,24小时后用含G418的培养液筛选。待形成阳性单细胞克隆群落后,用尖吸管吸取单克隆阳性细胞培养,筛选获得阳性细胞培养连续传代3次,建立稳定的细胞株。 [5]EGFP-核壳蛋白融合蛋白的鉴定:转染后用荧光显微镜观察有无荧光,以观察转染是否成功。Western blot鉴定核壳蛋白的表达,UVI凝胶成像系统分析条带灰度值,用核壳蛋白/β-actin代表核壳蛋白的相对表达量。 [6]HLA-A mRNA和蛋白表达的检测:常规方法提取细胞总RNA,按照RT-PCR试剂盒说明书进行逆转录反应和PCR扩增。经琼脂糖凝胶电泳,用凝胶分析系统对PCR产物进行定量分析。流式细胞术检测HLA-A蛋白的表达。将固定好的细胞每管加入一抗并处理标本,通过流式细胞仪进行检测,每个样品管检测5000个细胞。 [7]细胞株凋亡的诱导和检测:经Act-D及TNF-α诱导刺激各组HepG2细胞凋亡,刺激时间16h、32h、48h,使用流式细胞术,利用碘化丙啶染色,检测具有亚G1期DNA含量的细胞比例,代表凋亡细胞数;使用激光共聚焦显微镜,利用Hoechst染色观察32h时各组凋亡细胞核的变化。 [8]细胞株凋亡相关通路信号蛋白表达检测:空质粒、pEGFP-WT、pEGFP-V60、pEGFP-L97表达HepG2细胞株培养48h时,提取总蛋白,Western blot检测IKK-α、IκB-α、NF-κB P65、Caspase-8和caspase-3蛋白在各组中的表达。 结果 [1]PCR成功扩增野毒株核壳蛋白基因;成功将PCR产物连接到pMD18载体;将双酶切后的HBV/C区基因切下并连接到pEGFP-C1上,成功构建野毒株核壳蛋白表达载体pEGFP-WT,酶切和测序鉴定符合实验所需;利用特异性引物成功地在pEGFP-WT基础上实行了定点突变,获得带EGFP与野毒株、L60V、197L变异核壳蛋白的融合蛋白表达重组载体pEGFP-V60和pEGFP-L97,并经测序证实。 [2]pEGFP-V60、pEGFP-L97、pEGFP-WT载体和空质粒pEGFP-C1表达细胞株的构建、筛选和鉴定:HepG2细胞的G418最低有效全致死剂量为200gg/mL,确定筛选用浓度为400gg/mL,维持浓度为300μg/mL。通过Lipofectamine转染空质粒、pEGFP-V60、pEGFP-L97和pEGFP-WT进入HepG2细胞,G418筛选2周,挑取阳性细胞单克隆株。荧光显微镜显示EGFP在各细胞系强表达;Western blot检测各细胞系核壳蛋白表达量无明显差别(p>0.05)。 [3]pEGFP-V60、pEGFP-L97、pEGFP-WT和空质粒pEGFP-C1组HepG2细胞株HLA-A mRNA和蛋白表达结果:RT-PCR检测结果表明,空质粒表达HepG2细胞株没有检测到HLA-A mRNA表达,pEGFP-L97组细胞株HLA-A mRNA表达明显高于pEGFP-WT组细胞株,而pEGFP-V60组细胞株HLA-A mRNA表达明显低于pEGFP-WT组细胞株(p<0.05)。流式细胞术检测表明,pEGFP-V60组细胞株HLA-A表达水平明显低于pEGFP-WT组细胞株,而pEGFP-L97组细胞株HLA-A表达明显高于pEGFP-WT组细胞株(p<0.05)。 [4]流式细胞术检测pEGFP-V60、pEGFP-L97、pEGFP-WT载体和空质粒pEGFP-C1组HepG2细胞株凋亡结果:在16h,32h,48h时,pEGFP-V60、pEGFP-L97和pEGFP-WT组细胞株凋亡率均明显低于空白质粒组细胞株(p均<0.05);16h时pEGFP-L97组细胞株凋亡比例明显高于pEGFP-WT组细胞株(p<0.05),32h时pEGFP-V60组细胞株凋亡比例明显高于pEGFP-WT组细胞株(p<0.05)。48h时,pEGFP-V60、pEGFP-L97组细胞株的凋亡率均明显高于pEGFP-WT组细胞株(p均<0.05)。未加刺激因素的各组细胞株在0h时和48h时的凋亡率均无明显变化。 [5]激光共聚焦检测细胞凋亡结果:32h时pEGFP-V60、pEGFP-L97组细胞株凋亡比例均明显高于pEGFP-WT组细胞株(p均<0.05),但低于空白质粒组细胞株(p<0.05),与流式细胞术的结果相一致。 [6]pEGFP-V60、pEGFP-L97、pEGFP-WT载体和空质粒pEGFP-C1组HepG2细胞株凋亡相关信号通路蛋白检测:各组细胞株NF-κB、IKK-α、IκB-α蛋白表达没有明显差别;但pEGFP-WT组细胞株caspase-3,8表达低于pEGFP-V60、pEGFP-L97组细胞株;且三组细胞株caspase-3,8表达均低于空白质粒组细胞株。 结论 [1]我们成功地克隆了EGFP与野毒株核壳蛋白以及L60V、197L变异核壳蛋白融合表达载体;野毒株核壳蛋白以及L60V、197L变异核壳蛋白细胞株HBcAg表达量无明显差异,能够进一步进行各种核壳蛋白功能差异的研究。 [2]核壳蛋白能够刺激HepG2细胞HLA-A mRNA和蛋白的表达;与野毒株核壳蛋白相比,L60V变异核壳蛋白具有下调HepG2细胞HLA-AmRNA和蛋白表达作用,而197L变异核壳蛋白具有上调作用。其机制有待进一步研究。 [3]野毒株核壳蛋白具有抑制诱导的HepG2细胞凋亡作用;与野毒株核壳蛋白相比,L60V、197L变异核壳蛋白具有促进细胞凋亡的作用。 [4]L60V、197L变异核壳蛋白促进HepG2细胞凋亡作用,可能与L60V、197L变异核壳蛋白上调caspase-3,8表达有关。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 李发武;卢放根;;乙型肝炎病毒L60V、I97L变异核壳蛋白对HepG2细胞HLA-A表达的影响[J];中国人兽共患病学报;2007年05期
2 李发武;卢放根;;乙型肝炎病毒L60V、I97L变异核壳蛋白对诱导HepG2细胞凋亡的影响[J];四川医学;2007年01期
3 苏蔓;王振雷;戚海;胡光磊;李茵;郭霞;张泓楠;马程明;何路军;;河北汉族终末期肾功能衰竭患者HLA-A、B位点基因多态性分析[J];临床血液学杂志;2018年06期
4 张展;李静;张琳琳;贾莉婷;李辉;王婧彦;琚娟;荣守华;;父源性HLA-A基因与子痫前期相关性的研究[J];现代妇产科进展;2010年01期
5 蒋黎华;姜春晖;;上海地区急性前葡萄膜炎与HLA-A、B抗原相关性分析[J];临床和实验医学杂志;2007年01期
6 曹峰林;孙政育;方胜;王春梅;;特发性扩张型心肌病与HLA-A*基因的关联研究[J];中国地方病学杂志;2005年06期
7 施广德;王知笑;杨涛;;HLA-A基因与1型糖尿病早期胰岛功能的相关性研究[J];中国糖尿病杂志;2011年11期
8 李维宏;孙万邦;罗军敏;冯继红;黄学贵;张忆雄;;HLA-A、-B基因多态性与流行性出血热的相关性[J];免疫学杂志;2007年04期
9 张丰晓;吴继周;郑奕;李国坚;陈茂伟;吴健林;韦颖华;;HLA-A等位基因多态性对慢性乙肝病情的影响研究[J];临床肝胆病杂志;2008年06期
10 戴玮玮;陈明;汪莉萍;孙海丰;傅涓涓;李秀华;;徐州地区汉族人及慢性乙型肝炎HLA-A基因多态性的研究[J];临床肝胆病杂志;2007年02期
11 李成涛,李莉,柳燕,康敏华,李荣宇;寡核苷酸芯片技术在HLA-A抗原基因分型中的应用研究[J];法医学杂志;2005年04期
12 刘凯;谭遥;李亚伟;王多明;吾甫尔江·艾克木;王若峥;;新疆汉族鼻咽癌患者HLA-A* 02基因表达及多态性分析[J];上海交通大学学报(医学版);2015年01期
13 陈男英;何俊俊;章伟;王炜;韩浙东;朱发明;严力行;;HLA-A新等位基因HLA-A~* 110106的核苷酸序列分析[J];中国输血杂志;2009年02期
14 曹峰林;王树叶;李金梅;汤海蒂;王振坤;;阵发性睡眠性血红蛋白尿与HLA-A~*基因的关联研究[J];中国优生与遗传杂志;2009年12期
15 吕沁风;章伟;何吉;王炜;韩浙东;朱发明;严力行;;一例HLA-A新等位基因A~*3308的测序分析[J];中华医学遗传学杂志;2006年03期
16 李卫党,范丽安;HLA-A和B基因真核细胞表达载体的克隆及序列分析[J];免疫学杂志;2002年01期
17 陈之琦,杨珏琴,姚芳娟,范丽安,萧树东,陈仁彪;恶性贫血与HLA-A、B抗原关联的研究[J];上海第二医科大学学报;1993年04期
18 谭遥;王多明;黄莉;王若峥;;HLA-A*02基因型与新疆汉族鼻咽癌临床特征及预后关系[J];新疆医科大学学报;2015年01期
19 刘文忠;云宇光;陈阿梅;;内蒙古地区慢性粒细胞白血病患者HLA-A基因多态性的研究[J];中国优生与遗传杂志;2009年04期
20 王卓;刘辉;程艳杰;;HLA-A、B等位基因多态性与“长寿”的相关性及其可能的免疫学机制[J];中国老年学杂志;2007年08期
中国重要会议论文全文数据库 前20条
1 云宇光;娜琴;崔明玉;陈阿梅;;北方地区白血病患者HLA-A、B基因多态性的研究[A];北方遗传资源的保护与利用研讨会论文汇编[C];2010年
2 高素青;吴国光;邓志辉;金士正;张姝颖;;中国南方汉族急性淋巴细胞白血病与HLA-A基因相关性研究[A];中国输血协会第三届输血大会论文专辑[C];2004年
3 李鑫;丁镌;毕冬梅;王鑫;颜廷宇;刘颖;;HLA新等位基因HLA-A~*02:695的序列分析及确认[A];中国输血协会第九届输血大会论文专辑[C];2018年
4 张闿珍;张芳林;刘小莺;;慢性淋巴细胞性甲状腺炎与HLA-A、B、DR关联的研究[A];中华医学会第六次全国内分泌学术会议论文汇编[C];2001年
5 杨菲;张德梅;樊晓光;;原发性肾病综合征HLA-A、B、DR基因频率的研究[A];中国免疫学会第五届全国代表大会暨学术会议论文摘要[C];2006年
6 竺明晨;张义;赵胜梅;陆楠;万芙荣;李晓丽;王盛华;李英杰;李浩;邹雄;;结直肠肿瘤患者外周血单个核细胞表面HLA-A和HLA-B的表达[A];中华医学会第七次全国检验医学学术会议资料汇编[C];2008年
7 何静松;施继敏;谢万灼;罗依;李黎;陈水云;金爱云;胡晓蓉;蔡真;林茂芳;黄河;;HLA-A、B、DR配型对无关供者异基因造血干细胞移植的影响[A];2007年浙江省器官移植学术会议论文汇编[C];2007年
8 乔淑凯;郭晓楠;刘艳平;徐世荣;;河北汉族人群HLA-A、B、DRB1基因多态性与慢性粒细胞白血病的相关性研究[A];第七届全国血液免疫学学术大会暨2008年浙江省血液病学术年会论文汇编[C];2008年
9 李晓丰;章旭;林凤秋;张坤莲;李剑平;;HLA新等位基因HLA-A~*11:101的鉴定及确认[A];中国输血协会第八届输血大会论文专辑[C];2016年
10 张蕾;李新生;崔保安;陈红英;孙凯;宋亚鹏;阮武营;;HLA-A胞外区成熟肽基因克隆及其原核表达载体的构建[A];中国畜牧兽医学会2009学术年会论文集(下册)[C];2009年
11 潘宁;孙杭;南大航;缪凤琴;张建琼;;HLA-A等位基因特异性定量PCR方法的建立[A];第八届全国免疫学学术大会论文集[C];2012年
12 克丙申;黄象艳;周仲玲;徐军;齐发莲;张京海;;中国人HLA-A位点内含子一核酸序列的初步研究[A];山东免疫学会、山东微生物学会医学微生物学专业委员会、山东省医学会微生物学和免疫学专业委员会、山东省医药生物技术学会2001年学术年会论文汇编[C];2001年
13 李王霞;;中华骨髓库湖北分库志愿者HLA-A~*02亚型基因多态性分析[A];中国输血协会第五届输血大会论文专集(摘要篇)[C];2010年
14 杜静文;周炜均;姜春俊;谢晓灵;张宏毫;贺艳杰;李玉华;;Eps8抗原HLA-A* 0201限制性天然CTL表位的预测和鉴定[A];第十四届全国肿瘤生物治疗大会论文集[C];2015年
15 毕冬梅;李鑫;丁镌;刘颖;关佩佩;芦凤亮;;新等位基因HLA-A~*24:385的序列分析[A];中国输血协会第九届输血大会论文专辑[C];2018年
16 丁镌;李鑫;毕冬梅;卢凤亮;姜鹏宇;刘颖;;新等位基因HLA-A~*02:697的序列分析[A];中国输血协会第九届输血大会论文专辑[C];2018年
17 刘曙光;孙玉英;骆媛;刘金锋;金荔;梁飞;袁方;刘楠;奚永志;;HLA-A~*110104新等位基因的克隆、序列分析与命名[A];第10届全国实验血液学会议论文摘要汇编[C];2005年
18 林乾飞;鞠瑞青;于江虹;于晓丽;任海波;;吉林省人群HLA-A、HLA-B、HLA-DR等位基因频率及临床意义[A];中国输血协会第四届输血大会论文集[C];2006年
19 姚宇峰;;一个隔离汉族群体HLA-A,-B,-C和-DRB1等位基因多态性及其单倍型的研究[A];中国遗传学会第八次代表大会暨学术讨论会论文摘要汇编(2004-2008)[C];2008年
20 张展;贾莉婷;张琳琳;;子痫前期患者HLA-A、HLA-B基因多态性分析[A];中华医学会第七次全国检验医学学术会议资料汇编[C];2008年
中国博士学位论文全文数据库 前8条
1 李发武;乙型肝炎病毒L60V、I97L变异核壳蛋白对HepG2细胞HLA-A表达和细胞凋亡的影响[D];中南大学;2007年
2 李迅;EBV阳性的维吾尔族霍奇金淋巴瘤与HLA-A高分辨等位基因多态性的相关研究[D];新疆医科大学;2013年
3 王宝梅;SARS冠状病毒S蛋白HLA-A~*0201限制性CD8~+T淋巴细胞表位的鉴定[D];第二军医大学;2004年
4 孙伟红;人磷脂酰乙醇胺结合蛋白4(hPEBP4)的HLA-A~*0201限制性CD8~+ CTL表位的鉴定及其功能研究[D];第二军医大学;2006年
5 韩世新;辽宁汉族群体HLA-A、B、C和DRB1等位基因分型及与神经纤维瘤病Ⅰ型相关性研究[D];中国医科大学;2004年
6 王岩;北方汉族寻常型银屑病与HLA-A、B、Cw、DR、DQ等位基因及血清瘦素相关性研究[D];中国医科大学;2005年
7 吕燕波;SARS-CoVN蛋白和S蛋白的HLA-A~*0201限制性保守CTL表位的鉴定[D];第三军医大学;2005年
8 杨磊;HLA-A、HLA-B、HLA-DRB1等位基因多态性与中国北方汉族肺癌患者遗传易感相关性的研究[D];北京市结核病胸部肿瘤研究所;2011年
中国硕士学位论文全文数据库 前20条
1 涂小宁;人内源性逆转录病毒包膜蛋白W家族(HERV-W env)的HLA-A~*0201限制性抗原表位多肽诱导CTL反应[D];武汉大学;2017年
2 努尔古力·乃依木;HLA-A基因多态性与新疆和田地区维吾尔族自然长寿人群的相关性研究[D];新疆医科大学;2018年
3 李静;父源性HLA-A基因与子痫前期相关性研究[D];郑州大学;2010年
4 成玉;中国HLA-A、B位点限制性多表位疫苗设计的理论免疫应答率预测系统研究[D];山东大学;2008年
5 陈歌子;琥珀酰明胶过敏与HLA-A、HLA-B基因多态性关系的研究[D];郑州大学;2016年
6 竺明晨;结直肠癌患者外周血单个核细胞HLA-A和HLA-B mRNA的表达及其临床意义[D];山东大学;2008年
7 刘曙光;HLA-A~*110104新等位基因的鉴定及其永生化细胞株的建立和生物学特性研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2006年
8 刘春枝;内蒙地区蒙古族儿童过敏性紫癜与HLA-A基因的关联性[D];内蒙古医学院;2007年
9 高志敏;先天性无阴道患者HLA-A、DRB1等位基因多态性研究及乙状结肠代阴道成形术后随访[D];河北医科大学;2007年
10 周广彪;潮汕汉族食管癌与HLA-A、B基因的相关性研究[D];汕头大学;2007年
11 谢毓滨;湖南汉族人群HLA-A、B、DRB1等位基因及单倍型多态性研究[D];中南大学;2007年
12 王威;HLA-A、B、C抗原在肺癌及其转移灶中的表达及临床意义[D];中国医科大学;2002年
13 张丰晓;HLA-A、DRB1等位基因与乙肝病情及病毒复制的相关性研究[D];广西医科大学;2006年
14 杨菲;原发性肾病综合征HLA-A、B、DR基因频率的研究[D];山西医科大学;2006年
15 王帅帅;MM/PBSA方法计算抗原短肽与HLA-A~*0201分子结合自由能[D];大连理工大学;2016年
16 吕琳;HLA-A~*0201基因胞外区片段的克隆、表达及多克隆抗体的制备[D];昆明医学院;2006年
17 钱亚云;可溶性HLA-A~*0201/CAP-1四聚体的构建及其在结直肠癌研究中的初步应用[D];扬州大学;2008年
18 郑奕;HLA-A、DRB1基因对慢性乙肝患者免疫水平的影响研究[D];广西医科大学;2006年
19 王文彬;HLA-A基因位点rs3094165(G>A)的多态性与冠心病的相关性研究[D];延边大学;2020年
20 郑锦飞;HLA-A~*0201基因转染云南宣威肺腺癌细胞XWLC-05抗肿瘤效应的研究[D];昆明医学院;2008年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978