乙型肝炎病毒L60V、I97L变异核壳蛋白对HepG2细胞HLA-A表达和细胞凋亡的影响

【摘要】： 背景 HBV感染后的肝病表现有很宽的临床谱，包括无症状携带状态、急性自限性肝炎、慢性活动性肝炎以及暴发性肝炎等。HBV感染者免疫清除病毒的主要效应细胞为CD_8~+T细胞(CTL)、Th细胞和B细胞，其中CTL介导的细胞特异性免疫是主要途径，决定着感染者的临床结局。免疫因素并不能完全解释HBV感染者复杂的临床转归，HBV变异是另一个影响临床结局的重要因素。近年来，很多HBV变异株被分离和鉴定，并对其生物学特性进行了广泛而深入的研究。核壳蛋白是宿主细胞免疫的核心靶位，在病毒清除和病理损伤过程中起着重要作用，因此HBV／C区基因变异和氨基酸的改变格外引人关注。累计文献和资料，核壳蛋白常见的变异包括P5T、V13A、S35A、L59V、P68L、P130T和P135Q等，这些位点变异对肝细胞损伤无明显影响作用，主要见于无症状携带者，可能是不同地理环境病毒自然进化的结果；核壳蛋白L60V(AA60的亮氨酸被缬氨酸替代)和197L(AA97的异亮氨酸被亮氨酸替代)变异常见于活动性乙型肝炎，L60V、197L变异是否加重肝损伤及其作用机制尚不清楚。通过构建L60V、197L变异HBV全基因表达质粒，转染HepG2细胞，结果表明L60V、197L变异HBV株与野毒株HBV对细胞HLA-Ⅰ表达有不同影响作用；L60V、197L变异HBV全基因重组腺病毒载体注射到小鼠体内的研究表明，L60V、197L变异病毒株更容易免疫逃避。目前关于核壳蛋白功能研究尚少见。野毒株、L60V、197L变异核壳蛋白对细胞HLA-Ⅰ表达的影响作用尚不清楚。HBV全基因组对诱导的细胞凋亡有抵抗作用，但野毒株、L60V、197L变异核壳蛋白对诱导的细胞凋亡是否存在影响尚不清楚。 目的 研究野毒株核壳蛋白、L60V、197L变异核壳蛋白对HepG2细胞HLA-A表达的影响；研究野毒株核壳蛋白、L60V、197L变异核壳蛋白对诱导HepG2细胞凋亡的影响，通过细胞水平的研究以探讨C区热点变异核壳蛋白与野毒株可能存在的功能差异。 方法 [1]野毒株C区基因的获得：以P3.8Ⅱ为模板，PCR反应扩增野毒株核壳蛋白基因全长，两端带有EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点。扩增的PCR产物通过琼脂糖凝胶试剂盒回收纯化产物。将纯化的PCR产物与pMD18—T载体连接，转化DH5α克隆扩增，筛选阳性克隆，提取质粒pMD18—HBV／C区基因酶切鉴定。 [2]野毒株核壳蛋白表达载体pEGFP-WT的构建：将pEGFP-C1质粒转化扩增，EcaRⅠ和BamHⅠ双酶切，琼脂糖电泳后回收大片段；质粒pMD18—HBV／C区基因EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切，琼脂糖电泳后回收小片段。将酶切后的pEGFP-C1质粒与HBV／C区基因进行连接。连接产物转化DH5α克隆扩增，筛选阳性克隆，提取质粒，获得野毒株表达载体pEGFP-WT，酶切和测序鉴定。 [3]pEGFP-L97和pEGFP-V60重组载体的获得：通过Quick Change试剂盒在pEGFP-WT的基础上采用特异性引物进行定点突变，PCR反应产物DpnI酶切，转化XL2-Blue超级感受态细胞，铺板挑取突变克隆，筛出新合成的含突变子链的重组载体，酶切测序鉴定。 [4]重组载体的转染：用Lipofectamine 2000~(TM)将pEGFP-C1、pEGFP-WT、pEGFP-V60和pEGFP-L97转染HepG2细胞，6小时后更换为无抗生素的含10％小牛血清的DMEM培养液，24小时后用含G418的培养液筛选。待形成阳性单细胞克隆群落后，用尖吸管吸取单克隆阳性细胞培养，筛选获得阳性细胞培养连续传代3次，建立稳定的细胞株。 [5]EGFP-核壳蛋白融合蛋白的鉴定：转染后用荧光显微镜观察有无荧光，以观察转染是否成功。Western blot鉴定核壳蛋白的表达，UVI凝胶成像系统分析条带灰度值，用核壳蛋白／β-actin代表核壳蛋白的相对表达量。 [6]HLA-A mRNA和蛋白表达的检测：常规方法提取细胞总RNA，按照RT-PCR试剂盒说明书进行逆转录反应和PCR扩增。经琼脂糖凝胶电泳，用凝胶分析系统对PCR产物进行定量分析。流式细胞术检测HLA-A蛋白的表达。将固定好的细胞每管加入一抗并处理标本，通过流式细胞仪进行检测，每个样品管检测5000个细胞。 [7]细胞株凋亡的诱导和检测：经Act-D及TNF-α诱导刺激各组HepG2细胞凋亡，刺激时间16h、32h、48h，使用流式细胞术，利用碘化丙啶染色，检测具有亚G1期DNA含量的细胞比例，代表凋亡细胞数；使用激光共聚焦显微镜，利用Hoechst染色观察32h时各组凋亡细胞核的变化。 [8]细胞株凋亡相关通路信号蛋白表达检测：空质粒、pEGFP-WT、pEGFP-V60、pEGFP-L97表达HepG2细胞株培养48h时，提取总蛋白，Western blot检测IKK-α、IκB-α、NF-κB P65、Caspase-8和caspase-3蛋白在各组中的表达。 结果 [1]PCR成功扩增野毒株核壳蛋白基因；成功将PCR产物连接到pMD18载体；将双酶切后的HBV／C区基因切下并连接到pEGFP-C1上，成功构建野毒株核壳蛋白表达载体pEGFP-WT，酶切和测序鉴定符合实验所需；利用特异性引物成功地在pEGFP-WT基础上实行了定点突变，获得带EGFP与野毒株、L60V、197L变异核壳蛋白的融合蛋白表达重组载体pEGFP-V60和pEGFP-L97，并经测序证实。 [2]pEGFP-V60、pEGFP-L97、pEGFP-WT载体和空质粒pEGFP-C1表达细胞株的构建、筛选和鉴定：HepG2细胞的G418最低有效全致死剂量为200gg／mL，确定筛选用浓度为400gg／mL，维持浓度为300μg／mL。通过Lipofectamine转染空质粒、pEGFP-V60、pEGFP-L97和pEGFP-WT进入HepG2细胞，G418筛选2周，挑取阳性细胞单克隆株。荧光显微镜显示EGFP在各细胞系强表达；Western blot检测各细胞系核壳蛋白表达量无明显差别(p＞0.05)。 [3]pEGFP-V60、pEGFP-L97、pEGFP-WT和空质粒pEGFP-C1组HepG2细胞株HLA-A mRNA和蛋白表达结果：RT-PCR检测结果表明，空质粒表达HepG2细胞株没有检测到HLA-A mRNA表达，pEGFP-L97组细胞株HLA-A mRNA表达明显高于pEGFP-WT组细胞株，而pEGFP-V60组细胞株HLA-A mRNA表达明显低于pEGFP-WT组细胞株(p＜0.05)。流式细胞术检测表明，pEGFP-V60组细胞株HLA-A表达水平明显低于pEGFP-WT组细胞株，而pEGFP-L97组细胞株HLA-A表达明显高于pEGFP-WT组细胞株(p＜0.05)。 [4]流式细胞术检测pEGFP-V60、pEGFP-L97、pEGFP-WT载体和空质粒pEGFP-C1组HepG2细胞株凋亡结果：在16h，32h，48h时，pEGFP-V60、pEGFP-L97和pEGFP-WT组细胞株凋亡率均明显低于空白质粒组细胞株(p均＜0.05)；16h时pEGFP-L97组细胞株凋亡比例明显高于pEGFP-WT组细胞株(p＜0.05)，32h时pEGFP-V60组细胞株凋亡比例明显高于pEGFP-WT组细胞株(p＜0.05)。48h时，pEGFP-V60、pEGFP-L97组细胞株的凋亡率均明显高于pEGFP-WT组细胞株(p均＜0.05)。未加刺激因素的各组细胞株在0h时和48h时的凋亡率均无明显变化。 [5]激光共聚焦检测细胞凋亡结果：32h时pEGFP-V60、pEGFP-L97组细胞株凋亡比例均明显高于pEGFP-WT组细胞株(p均＜0.05)，但低于空白质粒组细胞株(p＜0.05)，与流式细胞术的结果相一致。 [6]pEGFP-V60、pEGFP-L97、pEGFP-WT载体和空质粒pEGFP-C1组HepG2细胞株凋亡相关信号通路蛋白检测：各组细胞株NF-κB、IKK-α、IκB-α蛋白表达没有明显差别；但pEGFP-WT组细胞株caspase-3，8表达低于pEGFP-V60、pEGFP-L97组细胞株；且三组细胞株caspase-3，8表达均低于空白质粒组细胞株。 结论 [1]我们成功地克隆了EGFP与野毒株核壳蛋白以及L60V、197L变异核壳蛋白融合表达载体；野毒株核壳蛋白以及L60V、197L变异核壳蛋白细胞株HBcAg表达量无明显差异，能够进一步进行各种核壳蛋白功能差异的研究。 [2]核壳蛋白能够刺激HepG2细胞HLA-A mRNA和蛋白的表达；与野毒株核壳蛋白相比，L60V变异核壳蛋白具有下调HepG2细胞HLA-AmRNA和蛋白表达作用，而197L变异核壳蛋白具有上调作用。其机制有待进一步研究。 [3]野毒株核壳蛋白具有抑制诱导的HepG2细胞凋亡作用；与野毒株核壳蛋白相比，L60V、197L变异核壳蛋白具有促进细胞凋亡的作用。 [4]L60V、197L变异核壳蛋白促进HepG2细胞凋亡作用，可能与L60V、197L变异核壳蛋白上调caspase-3，8表达有关。