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谷氨酸脱羧酶DNA疫苗预防糖尿病的实验研究

张松  
【摘要】: 1型糖尿病(type 1 diabetes mellitus,T1DM)是一种以分泌胰岛素的胰岛β细胞特异性损伤为特征的自身免疫性疾病。研究已经表明,CD4~+和CD8~+T淋巴细胞、巨噬细胞等均参与了对胰岛β细胞的破坏,而且凋亡是胰岛β细胞主要的死亡形式。T1DM的发病机制十分复杂,虽然目前仍不十分清楚,但越来越多的证据显示,Th1细胞及其细胞因子是导致胰岛β细胞的破坏的重要原因,而使免疫平衡向Th2方向偏移能够延缓甚至预防T1DM的发病。此外,CD4~+CD25~+调节性T细胞在维持机体外周免疫耐受中发挥着十分重要的作用,诱导CD4~+CD25~+调节性T细胞的产生可以有效地预防和治疗T1DM。 研究发现,在T1DM患者发展成为显性糖尿病之前存在一个相对较长的临床前期,在此期进行有效的免疫干预有可能延缓甚至预防糖尿病的发生发展。因此,T1DM早期有效的干预方式已越来越受到人们的关注。机体重建对胰岛素自身抗原的免疫耐受是预防和治疗T1DM的重要手段之一,在目前报道的胰岛自身抗原中,谷氨酸脱羧酶(glutamic acid decarboxylase,GAD)65被认为是T1DM发生发展的关键抗原,而且研究显示GAD65能够通过诱导免疫耐受或者其他的机制,减轻胰岛炎,预防T1DM。 DNA疫苗由于其具有安全性高、制备简单经济、易于储存运输等特点,近年来已经在感染性疾病和肿瘤的预防中取得了较好的疗效。目前已有运用编码自身抗原GAD65的DNA疫苗对T1DM预防研究的报道,但是结果很不一致,甚至出现相反的结论。我们以前的研究结果也证明,编码人全长GAD65基因的DNA疫苗来说仅使人类T1DM理想的动物模型——非肥胖糖尿病(non-obese diabetic,NOD)鼠糖尿病的发病率降低30%左右,预防效果尚不理想,还有许多可以改进之处。 综上所述,本研究的目的在于:优化我们以前构建的编码全长GAD65基因的DNA疫苗,并对NOD鼠进行预防,进一步探讨其可能的机制,旨在为人类T1DM的预防进一步奠定实验基础。 本研究共分为三个部分:1.通过改良抗原基因序列、与细胞因子基因或其他胰岛自身抗原基因共表达的方法,构建和鉴定8种新的GAD65片段DNA疫苗,并在检测其表达。2.将构建好的8种GAD65片段DNA疫苗对NOD鼠进行预防实验,观察不同GAD65片段DNA疫苗对NOD鼠糖尿病发病和胰岛炎的作用。3.检测几种有效的GAD65片段DNA疫苗免疫对NOD鼠胰岛p细胞凋亡、免疫耐受、Th1/Th1免疫平衡、以及CD4~+CD25~+调节性T细胞的作用,探讨不同GAD65片段DNA疫苗预防NOD鼠糖尿病可能的作用机制。 第一部分GAD65片段DNA疫苗的构建、鉴定与优化 目的构建、鉴定和优化以预防1型糖尿病为目的的编码不同谷氨酸脱羧酶(GAD)65基因片段的DNA疫苗。 方法从GAD65质粒中扩增出GAD_(190-315)(GAD1)片段和GAD_(490-570)(GAD2)片段的cDNA,以ovedap PCR法将之分别与IL-2信号肽cDNA拼接,得到带信号肽的SGAD1、SGAD2融合基因。并分别以IL-4、IL-10及胰岛原质粒为模板,用PCR方法扩增出IL-4、IL-10和胰岛素B链(InsB)基因。SGAD1、SGAD2、IL-4、IL-10和InsB基因先克隆入pGEM-T载体后,先将SGAD1、SGAD2融合基因分别克隆入双启动子真核表达载体pBudCE4.1中,构建出2种单基因重组真核表达载体pBud-SGAD1和pBud-SGAD2,再分别将IL-4、IL-10、InsB基因克隆入真核表达载体pBud-SGAD1和pBud-SGAD2中,构建出pBud-SGAD1/IL-4、pBud-SGAD1/IL-10、pBud-SGAD1/InsB、pBud-SGAD2/IL-4、pBud-SGAD2/IL-10、pBud-SGAD2/InsB6种双基因重组真核表达载体。重组真核表达载体经测序鉴定正确后,用脂质体介导的方法体外转染COS-7细胞,转染后以蛋白质印迹法检测SGAD1、SGAD2及InsB的表达,ELISA方法检测细胞因子IL-4和IL-10的表达。 结果 (1)核酸序列测定表明克隆的SGAD1、SGAD2融合基因、IL-4、IL-10和InsB基因序列与报告序列一致,开放读码框正确。 (2)蛋白质印迹法检测到SGAD1、SGAD2和InsB在COS-7细胞中的表达,其中融合蛋白SGAD1和SGAD2可以分泌表达。 (3) ELISA方法检测到细胞因子IL-4和IL-10在COS-7细胞中的表达。 结论首次成功构建了pBud-SGAD1、pBud-SGAD2、pBud-SGAD1/IL-4、pBud-SGAD1/IL-10、pBud-SGAD1/InsB、pBud-SGAD2/IL-4、pBud-SGAD2/IL-10、pBud-SGAD2/InsB8种新的GAD65片段DNA疫苗,为1型糖尿病的DNA疫苗预防研究提供了实验基础。 第二部分GAD65片段DNA疫苗对NOD鼠糖尿病和胰岛炎的作用 目的探讨优化后的GAD65片段DNA疫苗对NOD鼠糖尿病发病和胰岛炎的作用。 方法3-4周龄NOD雌鼠随机分为PBS组(n=20)、pBudCE组(n=18)、GAD65组(n=18)、SGAD1组(n=17)、SGAD2组(n=18)、SGAD1/IL-4组(n=19)、SGAD1/IL-10组(n=17)、SGAD1/InsB组(n=20)、SGAD2/IL-4组(n=18)、SGAD2/IL-10组(n=17)和SGAD2/InsB组(n=19)11个组,分别肌肉注射PBS、pBudCE空质粒、pcDNA3.1(+)/GAD65 DNA疫苗和经过优化后的pBud-SGAD1、pBud-SGAD1/IL-4、pBud-SGAD1/IL-10、pBud-SGAD1/InsB、pBud-SGAD1、pBud-SGAD2/IL-4、pBud-SGAD2/IL-10、pBud-SGAD2/InsB DNA疫苗,注射量为75μg,一周后重复一次,两次共150μg。自10周龄开始,每周测尿糖一次,尿糖阳性后监测血糖,连续两次血糖≥16.7mmol/L即诊断为糖尿病,所有动物观察至发生糖尿病或者至30周龄。各组再取6-8只12周龄未发病小鼠胰腺HE染色观察胰岛炎情况。 结果 (1)与PBS组相比,SGAD1、SGAD1/IL-4和SGAD1/IL-10组NOD鼠糖尿病的发病明显降低(P<0.05或P<0.01)。 (2)无论与GAD65组相比,还是与SGAD1组相比,SGAD1/IL-4和SGAD1/IL-10组NOD鼠糖尿病的发病明显降低(P<0.05或P<0.01)。 (3)与PBS组相比,pBudCE、SGAD1/InsB、SGAD2、SGAD2/IL-4、SGAD2/IL-10和SGAD2/InsB组NOD鼠糖尿病的发病差异无显著性。 (5) 12周龄时,无论与PBS组或与GAD65组相比,pBud-SGAD1、pBud-SGAD1/IL-4、pBud-SGAD1/IL-10 DNA疫苗能够降低NOD鼠胰岛炎的严重程度(P<0.05或P<0.01)。 结论pBud-SGAD1、pBud-SGAD1/IL-4、pBud-SGAD1/IL-10DNA疫苗减轻胰岛炎和预防NOD鼠糖尿病的疗效优于pcDNA3.1(+)/GAD65 DNA疫苗,其中pBud-SGAD1/IL-4和pBud-SGAD1/IL-10 DNA疫苗的疗效更好。 第三部分GAD65片段DNA疫苗预防NOD鼠糖尿病的机制探讨 目的探讨优选的GAD65片段DNA疫苗预防NOD鼠胰岛炎和糖尿病的机制。 方法PBS组、pBudCE组、GAD65组、SGAD1组、SGAD1/IL-4组、SGAD1/IL-10组各取6-8只12周龄未发病NOD雌鼠并处死,TUNEL加SP免疫组织化学方法检测胰岛β细胞的凋亡情况;制备脾细胞悬液后,[~3H]掺入法检测脾细胞对特异性抗原GAD65的刺激增殖反应;流式细胞仪检测脾细胞中CD4~+CD25~+调节性T细胞的数量;ELISA方法测定抗原刺激后脾细胞培养上清中Th1细胞因子IFN-γ,Th2细胞因子IL-4、IL-10水平;RT-PCR方法检测脾脏内细胞因子IFN-γ、IL-4、IL-10和转录因子foxp3 mRNA的表达。 结果 (1) SGAD1、SGAD1/IL-4和SGAD1/IL-10组NOD鼠胰岛β细胞凋亡率均低于PBS组(均P<0.05)。 (2) GAD1、SGAD1/IL-4和SGAD1/IL-10组NOD鼠脾细胞特异性抗原刺激增殖反应低于PBS组(均P<0.01)。 (3) SGAD1、SGAD1/IL-4和SGAD1/IL-10组脾细胞培养上清中IFN-γ水平均低于PBS组(均P<0.01)和GAD65组(均P<0.01);SGAD1、SGAD1/IL-4和SGAD1/IL-10组脾脏中IFN-γmRNA表达水平也均低于PBS组(均P<0.01)和GAD65组(均P<0.01)。 (4) SGAD1、SGAD1/IL-4和SGAD1/IL-10组脾细胞培养上清中IL-4水平均高于PBS组(P<0.05或P<0.01),SGAD1/IL-4组的IL4水平高于GAD65组(P<0.05)GAD1、SGAD1/IL-4和SGAD1/IL-10组脾脏中IL-4 mRNA表达水平高于PBS组(P<0.05或P<0.01)和GAD65组(P<0.05或P<0.01)。 (5) SGAD1/IL-10组脾细胞培养上清中IL-10水平高于PBS组(P<0.05)和GAD65组(P<0.05);SGAD1/IL-4和SGAD1/IL-10组脾脏中IL-10 mRNA表达水平高于PBS组(P<0.05或P<0.01)和GAD65组(P<0.05)。 (6)各组间NOD鼠脾细胞中CD4~+CD25~+调节性T细胞的数量,以及脾脏中Foxp3 mRNA表达水平差异无显著性。 结论pBud-SGAD1、pBud-SGAD1/IL-4、pBud-SGAD1/IL-10DNA疫苗免疫NOD鼠后,下调Th1细胞因子IFN-γ,上调Th2细胞因子IL-4和IL-10,导致免疫平衡向Th2方向偏移,使NOD鼠胰岛炎减轻,胰岛β细胞凋亡减少,并诱导NOD鼠对自身抗原GAD65的免疫耐受,从而预防NOD鼠发生糖尿病。


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