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复灌Ⅰ号注射液对大鼠肢体缺血—再灌注损伤早期骨骼肌保护机制的研究

朱付平  
【摘要】: 第一部分复灌Ⅰ号注射液对大鼠肢体缺血-再灌注骨骼肌损伤保护机制的研究 第一章复灌Ⅰ号注射液对大鼠肢体缺血-再灌注氧化损伤的保护机制 目的:探讨复灌Ⅰ号注射液对大鼠肢体缺血-再灌注骨骼肌氧化损伤的保护机制。 方法:选用SD雄性大鼠56只,随机分为对照组(Control组)、缺血再灌注组(IR组)和复灌Ⅰ号药物干预组(Ⅰ-IR组)三大组。对照组8只(未造成缺血-再灌注损伤);缺血-再灌注组24只,再分为再灌注后2h(IR-2)、4h(IR-4)和8h(IR-8)三小组,每小组8只;复灌Ⅰ号药物干预组24只,再分为再灌注后2h(Ⅰ-IR-2)、4h(Ⅰ-IR-4)和8h(Ⅰ-IR-8)三小组,每小组8只。对照组所有大鼠用橡皮筋松弛环绕双后肢不阻断血流;IR组和Ⅰ-IR组,按张连元所报道的方法复制SD大鼠后肢缺血-再灌注模型。对照组动物不给药物;IR组于造成缺血前12小时、造成缺血时和再灌注时于腹腔内各注射生理盐水1ml;Ⅰ-IR组于造成缺血前12h、缺血时和再灌注时腹腔各注射复灌Ⅰ号注射液1ml。各组动物于相应时间点切取约1000mg右侧腓肠肌中部肌肉,冰盐水中快速洗去血液,滤纸吸干水份,剪碎制成匀浆,用于骨骼肌MDA、SOD、MPO的检测,另切取部分腓肠肌,固定于福尔马林溶液中行组织切片检查,再切取左后肢腓肠肌行干湿重比值的检查,然后于下腔静脉穿刺取血,离心,行血清MDA、SOD、MPO、NO检测。 结果:(1)MDA的检测结果:IR与Ⅰ-IR各组MDA含量均较对照组为高其差异有统计学意义(P<0.01),且在8h内随着时间的延长而逐渐增高。而复灌Ⅰ号干预各组在相应时间点均较IR组为低,除骨骼肌Ⅰ-IR-4组与IR-4组相比其差异为P<0.05外,其余各组间比较其P值均小于0.01。(2)SOD的检测结果:IR与Ⅰ-IR各组血清和骨骼肌SOD值均较对照组为低,其差异有统计学意义(P<0.01),在8h内其含量随时间的延长而逐渐降低。除血清Ⅰ-IR-2组与IR-2组相比其差异为P<0.05外,其余各时间点Ⅰ-IR组与IR组比较其P值均小于0.01。(3)MPO的检测结果:IR与Ⅰ-IR各组血清和骨骼肌MPO值均较对照组为高,其差异有统计学意义(P<0.01),在8h内随时间的延长其含量逐渐升高,而Ⅰ-IR各组在相应时间点上均较IR组为低,其差异均有统计学意义(P<0.01)。(4)骨骼肌干湿重的检测结果:IR与Ⅰ-IR各组骨骼肌水肿明显,8h内水肿逐渐增加,与对照组相比其差异有统计学意义(P<0.01),而Ⅰ-IR各组在相应时间点上水肿程度均较IR组为轻,除Ⅰ-IR-2组与IR-2组相比其差异为P<0.05外,其余各相应时间点Ⅰ-IR组与IR组间比较其P值均小于0.01。(5)血清NO的检测结果:在再灌注后2h时为最高,8h内随着时间的延长而逐渐下降,IR与Ⅰ-IR各组NO含量均较对照组为高,其差异有统计学意义(P<0.01),而Ⅰ-IR各组较IR组为低,其差异有统计学意义(P<0.01)。(6)组织切片的检测结果:缺血-再灌注组各时间点肌肉组织水肿、肌纤维断裂并有大量炎症细胞浸润,而复灌Ⅰ号注射液可明显减少炎症细胞的浸润,在肌肉细胞的水肿和肌纤维的损伤方面也有一定的减轻。 小结: 1.复灌Ⅰ号注射液可减少氧自由基的产生。 2.复灌Ⅰ号注射液可减轻SOD降低的程度,更有利于机体清除氧自由基。 3.复灌Ⅰ号注射液可降低PMN的游出数量,同时减少其在组织中的聚集,降低了炎症反应。 4.复灌Ⅰ号注射液可降低血清中NO的含量。 5.复灌Ⅰ号注射液可减轻组织水肿程度。 第二章复灌Ⅰ号注射液对大鼠肢体缺血-再灌注损伤骨骼肌细胞凋亡的影响研究 目的:探讨复灌Ⅰ号注射液对大鼠肢体缺血-再灌注骨骼肌细胞凋亡的影响。 方法:将第一部分所取的部分骨骼肌标本进行固定、脱水、包埋后切片,采用SABC法进行免疫组化染色,经Motic Image advanced 3.1图像分析系统测定Bax、Bcl-2蛋白灰度值,然后对Bax、Bcl-2免疫组化阳性反应产物进行定量分析。 结果:骨骼肌组织经Bax、Bcl-2免疫组化染色后,高倍镜下胞浆染色为棕黄色为阳性表达,标记强度用灰度值表达,阳性表达愈强,灰度值愈低。应用图像分析系统(Motic Image advanced 3.1北京航天航空大学产品)测定Bax、Bcl-2蛋白灰度值。(1)Bax免疫组化结果示:对照组骨骼肌组织中未见有阳性细胞表达,Bax灰度值为188.50±13.43,在再灌注损伤8h内,IR组与Ⅰ-IR组各时间点灰度值随时间的延长而逐渐下降,说明Bax表达随再灌注时间延长而增强,除IR-2组和Ⅰ-IR-2组与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05),其余各组与对照组比,其差异均有统计学意义(P<0.01);但Ⅰ-IR各组在相应时间点上其灰度值均较IR组为高,除2h时其差异无统计学意义(P>0.05)外,其余各时间点其差异均有统计学意义(P<0.05);(2)Bcl-2免疫组化结果示:对照组未见阳性细胞表达,Bcl-2灰度值为183.75±8.28,再灌注损伤8h内,2h时表达最为明显,其后随时间的延长其表达逐渐减弱,灰度值逐渐升高,与对照组相比,其差异有统计学意义(P<0.01)。与IR组相比,Ⅰ-IR组各时间点的阳性表达均稍高,除2h外,其他各时间点差异均有统计学意义(P<0.01);(3)Bcl-2/Bax结果示:再灌注8h内,随时间的延长,其比值逐渐增加,说明其细胞凋亡越来越重,但Ⅰ-IR各组在相同时间点上较IR各组为低,除2h时间点外,其他时间点其差异均有统计学意义(P<0.05),说明复灌Ⅰ号注射液在缺血-再灌注损伤中有抗骨骼肌细胞凋亡的作用。 小结: 复灌Ⅰ号注射液可以降低Bax的表达,升高Bcl-2的表达,从而减少骨骼肌细胞凋亡,对肢体缺血-再灌注损伤的骨骼肌起到一定的保护作用。 第二部分大鼠肢体缺血-再灌注损伤骨骼肌钙调蛋白表达的变化及复灌Ⅰ号注射液对其影响的研究 目的:探讨大鼠肢体缺血-再灌注损伤骨骼肌钙调蛋白表达的变化以及复灌Ⅰ号注射液对变化的影响。 方法:54只SD大鼠随机分为3大组,分别为对照组(control组)、缺血-再灌注组(IR组)和复灌Ⅰ号药物干预组(Ⅰ-IR组)。对照组6只;缺血-再灌注组24只,再分为再灌注后0h(IR-0组)、2h(IR-2组)、4h(IR-4组)和8h(IR-8组)四小组,每小组6只;复灌Ⅰ号药物干预组24只,再分为再灌注后0h(Ⅰ-IR-0组)、2h(Ⅰ-IR-2组)、4h(Ⅰ-IR-4组)和8h(Ⅰ-IR-8组)四小组,每小组6只。对照组所有大鼠用橡皮筋松弛环绕右后肢不阻断血流;IR组和Ⅰ-IR组,按张连元所报道的方法复制SD大鼠右后肢缺血-再灌注模型。对照组动物处死前不给药物,缺血-再灌注组于造成缺血前12小时、造成缺血时和再灌注时于腹腔内各注射生理盐水1ml;复灌Ⅰ号药物干预组于造成缺血前12h、缺血时和再灌注时腹腔各注射复灌1号注射液1ml。各组动物于相应时间点在右后肢相应区域内剪毛,络合碘消毒,于右后肢后内侧沿肢体长轴方向切开皮肤,游离皮肤及皮下组织,剪除深筋膜,切取约1000mg腓肠肌,冰盐水快速洗去血液,滤纸吸干水份,剪碎制成组织匀浆,用于RyR_1和SERCA_1的RT-PCR检测。 结果: (1)骨骼肌型RyR_1mRNA的RT-PCR结果:在肢体缺血-再灌注损伤再灌注8h内,IR组骨骼肌型RyR_1mRNA在再灌注0h、2h表达上调,与对照组相比,其差异有显著性意义(P<0.01),4h时有所恢复,但8h时表达下调,与对照组相比,其差异有统计学意义(P<0.01)。复灌Ⅰ号注射液干预组0h稍有增强,增强幅度较IR组为小,与对照组和IR组相比其差异均无统计学意义(P>0.05),缺血2h时其表达也最强,但要比IR为弱,两组差异有统计学意义(P<0.01),4h时与对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05),8h也表现为降低,但降幅要比IR组为小,其差异有统计学意义(P<0.05)。(2)SERCA_1mRNA的RT-PCR结果:对于SERCA_1mRNA的表达,再灌注8h内随时间的延长其表达逐渐下降,与对照组相比,其差异均有统计学意义(P<0.01)。复灌Ⅰ号注射液干预各组的表达也随时间延长而下降,但下降幅度较IR组为小,可减缓其下降速度,与IR组相比,除2h时外,在0h(P<0.05)、4h(P<0.01)、8h(P<0.01)等时间点其差异均有统计学意义。 小结: 1.在再灌注8h内,肢体缺血-再灌注损伤骨骼肌中RyR_1mRNA早期表达上调,后期表达下降,SERCA_1mRNA表达随时间的延长而逐渐下降。这可能是肢体缺血-再灌注骨骼肌损伤的重要原因之一。 2.复灌Ⅰ号对缺血-再灌注损伤中骨骼肌的保护作用可能是通过双向调节RyR_1以使早期减轻胞浆钙超载,后期保护细胞器的作用来实现的。这可能是其防治肢体缺血-再灌注损伤,减轻骨骼肌损伤的主要分子机制之一。


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1 朱付平;复灌Ⅰ号注射液对大鼠肢体缺血—再灌注损伤早期骨骼肌保护机制的研究[D];中南大学;2007年
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