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在铜矿矿坑水微生物群落结构与功能研究中基因芯片技术的发展和应用

尹华群  
【摘要】: 金属硫化矿的生物氧化作用导致了大量酸性浸矿水(AMD)的产生,并造成了无数的环境污染。同时,在AMD环境中生存着各种各样的嗜酸性微生物,这些微生物不仅参与了AMD的形成,同时也对金属的生物浸出及环境的生物治理具有重要的意义。本文从微生物群落的多样性及群落功能等方面对德兴铜矿酸性浸矿水进行了系统的研究。 本研究首先采用16S rRNA和gyrB基因作为分子标尺对来自德兴铜矿6个酸性浸矿水样品中微生物群落的多样性进行了研究。其结果显示,在德兴铜矿中的微生物主要属于Proteobacteria,Acidobacteria,Actinobacteria,Nitospira,Firmicute和Chlorella。通过主成分分析(PCA)发现,样品的地理化学变量对微生物群落的结构产生重要的影响。物理化学变量相似的样品中,其微生物群落结构更相似。通过典范相关分析(CCA)表明,其影响微生物群落结构变化的两个主要因素是铁和硫的浓度。但是,对微生物群落结构产生强烈影响的环境变量在不同的样点也各有不同。 通过比较16S rRNA和gyrB基因对微生物群落多样性的分析,揭示了gyrB基因在微生物群落结构研究中能够提供比16S rRNA更精确的信息,其更能反映微生物群落的本质。首先,我们利用两个不同矿区的酸性矿坑水样品对16S rRNA和gyrB基因在微生物群落多样性的应用进行了评估,其结果表明,两个分子标尺所显示的微生物群落组成基本相似。但就Shannon多样性指数而言,利用gyrB基因分析的微生物群落的多样性远远高于利用16S rRNA分析所得到的微生物群落丰度。在系统发育树分析上,gyrB基因能够很清楚地辨别那些关系很近的近亲菌株,这一点在纯培养A.ferrooxidans的分析中得到了进一步的验证。在以上分析的基础上,我们利用16S rRNA和gyrB基因对德兴铜矿4个AMD样品进行了分析,其结果也证明了上述观点。此外,我们也发现,在微生物群落的组成与地理化学变量相关性分析上,gyrB基因显示出更好的分析能力。 基因芯片技术因其独特的优势已被广泛应用于微生物群落结构与功能的研究中,但是,到目前为止,还没有有关基因芯片技术应用于酸性环境中的报道。为了有效的监控酸性环境和生物浸出系统中的微生物群落活动,基于已知的嗜酸细菌的基因序列我们开发了一种50mer寡核苷酸芯片,这一芯片包含了1072中独特的探针,其中包括571个16S rRNA探针和501个功能基因探针。这个芯片中的功能基因分别涉及到碳代谢(158),氮代谢(72),硫代谢(39),铁代谢(68),遗传(97),金属抗性(27),膜相关基因(16),转座子(13)和IST序列(11)。并对其特异性、灵敏度及定量性能进行了评估。芯片杂交的结果显示,探针对于特定基因的PCR产物具有很强的特异性,在没有背景DNA存在的条件下,芯片对于基因组DNA的检测极限为5ng,芯片的信号强度和模板DNA的浓度之间存在着很强的线性关系(r~2=0.98)。此外,芯片与自然酸性环境和生物浸出系统中样品的杂交结果显示这种芯片能够有效的分辨酸性生态系统中微生物群落结构与功能的差异性。 利用构建的基因芯片,我们对德兴铜矿酸性浸矿水样品进行了分析。其芯片上有关16S rRNA的结果与通过传统的16S rRNA PCR方法得到的结果保持一致。如,在SLS和YTW样品中,其优势种群主要为A.ferrooxidans;在芯片上,有关A.ferrooxidans菌的探针有很强的杂交信号。建立在16S rRNA的聚类分析显示,SLS和YTW聚在一块,两者有相似的微生物群落结构。这一结果与前面传统分子方法分析的结果也保持一致。通过功能基因进行聚类分析发现,一些与微生物能量代谢相关的基因聚在一块,有较强的杂交信号,这说明在AMD环境中微生物的能量代谢活动活跃,这与在这一环境中的微生物主要是利用亚铁或者硫作为能源有关,与此有关能量代谢的基因必然丰度很高。


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