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TIMP-1转基因小鼠拮抗多次小剂量链脲佐菌素诱导糖尿病及其机制研究

姜宏卫  
【摘要】: 背景与目的胰岛β细胞自身免疫性破坏导致1型糖尿病的发生,而其增殖能力非常有限,以至于在受到广泛破坏后不能够复制、新生足够有功能的胰岛β细胞。金属蛋白酶抑制物-1(Tissueinhibitor of metalloproteinase-1,TIMP-1)作为一种多功能蛋白,可抑制基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinase,MMP)活性,调控多种类型细胞的增殖、凋亡,以及炎症反应,包括在体外拮抗细胞因子对大鼠胰岛β细胞及细胞株的毒性作用。本实验旨在观察,给予注射多次小剂量链脲佐菌素(multiple low dose streptozotocin,MLDS)后,人TIMP-1转基因小鼠(TG)过表达人TIMP-1对糖尿病发生、胰岛炎、胰岛β细胞凋亡及增殖的影响;并在NIT-1细胞中进一步验证其促存活及促有丝分裂作用,初步探讨了其作用机制。 方法鉴定并检测TG小鼠胰腺人TIMP-1表达,观察体重、血糖、血清胰岛素、糖耐量、胰岛素耐量等相关代谢参数;给予同周龄、体重匹配的TG小鼠和非转基因(Con)小鼠链脲佐菌素(STZ)40mg·kg~(-1)·d~(-1)连续5d,观察小鼠尿量、饮水、摄食量、体重、血糖及死亡率变化,利用苏木素伊红(Hematoxylin-Eosin,HE)、胰岛素染色、脱氧核糖核酸末端转移酶介导的dUTP缺口末端标记(Terminal deoxynucleotidyl transferase biotin-dUTP nick endlabeling,TUNEL)染色及5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2-deoxyuridine,BrdU)标记等组织学及免疫组织化学方法评估胰岛炎、胰岛细胞β细胞凋亡、增殖及胰岛β细胞量的变化。转染并筛选稳定表达人TIMP-1的NIT-1细胞,通过MTT、Hoechst33342/溴化丙啶(PI)染色、BrdU摄取等方法,以及MMP、PI3K及MEK抑制剂的应用,Western blot分析Akt、ERK磷酸化水平,验证TIMP-1拮抗STZ对β细胞的直接毒性作用,并初步探讨了TIMP-1上述作用的机制。 结果(1)尾DNA PCR鉴定TIMP-1转基因小鼠,Northern blot分析表明,TG小鼠可见胰腺人TIMP-1高水平表达,而Con小鼠未见表达;相关代谢指标显示,Con与TG小鼠的空腹血糖、血清胰岛素水平、经腹腔葡萄糖耐量和胰岛素耐量实验均无显著差异,胰岛α细胞的分布和所占胰岛比例也无显著差异。给予MLDS后,Con小鼠FBG显著升高,伴有明显的多尿、多饮、多食、体重减轻及酮症,低胰岛素血症,并在17周(w)内相继死亡;TG小鼠血糖升高程度相较低(2w:TG,13.0±1.3 mmol/L vs.Con,24.5±1.6mmol/L,P<0.0001),胰岛素水平虽然也明显下降,但仍然显著高于Con小鼠,并且在12w后TG小鼠血糖水平逐渐回落,胰岛素水平逐渐回升,大部分TG小鼠(83%)存活下来。组织及免疫组织化学分析显示,MLDS处理后Con小鼠约40%胰岛出现不同程度的胰岛炎(Ⅰ~Ⅳ级)、凋亡胰岛细胞显著增加及胰岛β细胞量严重丢失;而TG小鼠仅6%左右胰岛出现轻度胰岛炎(Ⅰ级),显著低于Con组(P=0.000),凋亡胰岛细胞显著少于Con组(P<0.05),残存胰岛β细胞量显著高于Con组(P<0.05),并且MLDS处理40 w后,胰岛β细胞量基本恢复正常;另外,胰岛β细胞增殖评估显示,MLDS处理后TG小鼠和Con小鼠胰岛细胞增殖均明显增加,TG小鼠增加更为显著(P<0.05)。(2)G418筛选4 w获得稳定表达hTIMP-1的NIT-1细胞;STZ可呈时间和剂量依赖性的抑制NIT-1细胞活性,而过表达TIMP-1可拮抗STZ毒性,降低STZ诱导的NIT-1死亡,增加NIT-1的存活,但PI3K抑制剂LY294002及MEK抑制剂U0126可抵消其保护作用,MMP抑制剂GM6001、强力霉素均不能拮抗STZ对NIT-1细胞的毒性作用。Western blot分析显示,TIMP-1组Akt、ERK1/2磷酸化水平增加。 结论过表达TIMP-1不仅可减轻MLDS诱导的高血糖,而且有利于胰岛遭破坏后的恢复;其机制可能与TIMP-1抗凋亡、促增殖作用有关,Akt和ERK途径可能参与了TIMP-1的上述作用。


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