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TNF-α对COPD营养不良动物模型骨骼肌蛋白质分解代谢的影响及可能的机制

孙圣华  
【摘要】: 背景:慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是一种具有气流受限特征的肺部疾病,气流受限不完全可逆,呈进行性发展。COPD是呼吸系统的常见病和多发病。在20世纪80年代,就有一些研究者发现COPD合并营养不良的发生率很高,而近年来的研究数据统计约25%-65%的COPD患者在其自然病程中存在显著的渐进的体重减轻,进一步的研究证实营养状况是COPD不依赖于肺功能独立的预后因子,营养不良是独立于气流阻塞程度之外的影响COPD患者预后和死亡率的危险因素。COPD营养不良的表现并不是单一的体重下降,身体肌肉量的减少也是营养不良的表现,而且是重要的病理结果。研究证明,COPD患者的肌肉含量是一个比实际体重与理想体重之比(%IBW)更好的疾病预测指标,强调肌肉的减少在COPD疾病发展和预后中的意义。COPD营养不良特别是肌肉的营养不良已经成为呼吸内科研究的热点之一。 目前,国内外对COPD患者营养不良的研究涉及三个方面:1、COPD患者发生营养不良的机理;2、营养不良对COPD患者的影响;3、对COPD营养不良患者的干预。其研究终点是对COPD营养不良患者采取干预,改善甚至预防营养不良的发生。而研究的基础与核心是COPD发生营养不良的机理。 有关COPD患者营养不良的发生机理尚未完全阐明,目前认为COPD患者营养不良的发生的相关因素包括:营养物质的摄入与能量的消耗失衡、组织缺氧、废用性萎缩和细胞因子。上述的各种机制中,在早期国内外对营养物质的摄入与能量的消耗研究颇多,认为摄入少、消耗多是COPD患者营养不良发生的病因,但有荟萃分析分析了营养支持疗法对,COPD营养不良的效果,发现口服营养支持的疗效很小,而针对组织缺氧、废用性萎缩的治疗如氧疗和功能锻炼的效果同样欠佳,提示这三种因素在COPD营养不良的发生中作用可能较小。近年研究表明:COPD患者营养不良与细胞因子介导的代谢紊乱有关,多种细胞因子的联合作用影响着这一病理生理过程,通过影响机体的能量代谢和物质代谢导致了COPD营养不良的发生。所以,国内外的研究者逐渐将研究的中心转移至研究细胞因子在COPD患者营养不良发生中的影响。 目前较肯定的与COPD营养不良有明显相关性的炎症细胞因子是肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)。TNF-α是最早证明与恶病质相关的因子。TNF-α是由单核巨噬细胞产生,并可直接影响炎症反应的细胞因子,其生物活性广泛,除了抗肿瘤作用外,还参与炎症、发热以及调节机体脂肪、蛋白质的分解代谢等病理生理过程。国内外较多的研究都发现在营养不良的稳定期COPD患者中,血清TNF-α水平较营养正常的患者明显升高,提示TNF-α系统的激活与COPD营养不良有关,我们前期的临床研究也有相同的发现。但目前尚没有研究其作用机制的报道。动物实验中静脉注射TNF-α可导致蛋白质的分解代谢增加。在营养学及癌症恶病质的研究领域中,众多的研究发现TNF-α可明显地增加入的脂肪和蛋白质的分解代谢,从而导致营养状况的恶化。而目前尚没有有关TNF-α影响COPD营养不良骨骼肌蛋白分解代谢的报道。本课题基于COPD营养不良特别是肌肉的营养不良在COPD疾病发展和预后中的重要意义,研究COPD营养不良大鼠模型骨骼肌蛋白质分解代谢的特点以及TNF-α是否影响COPD营养不良大鼠模型骨骼肌蛋白质分解代谢,并探讨其可能的机制。为此,我完成了以下研究: 第一部分:COPD大鼠模型血清TNF-α的变化及与营养状态的关系、骨骼肌组织TNF-α的变化及与骨骼肌蛋白质分解代谢率的关系。 目的:建立COPD大鼠模型,观察大鼠营养状态和骨骼肌蛋白质分解代谢率的变化,观察血清TNF-α的变化及与营养状态的关系、骨骼肌组织TNF-α的变化及与骨骼肌蛋白质分解代谢率的关系;对部分发生营养不良的大鼠采用肿瘤坏死因子单克隆抗体(TNF-αMcAb)静脉注射进行干预,观察上述指标的变化,明确TNF-α是否对COPD模型大鼠的营养状态和骨骼肌蛋白质分解代谢率有影响。 方法:将90只健康Wistar大鼠随机分为模型组70只,对照组20只。模型组采用气管内注入猪胰弹性蛋白酶(PPE)和熏香烟的方法建立COPD大鼠模型。对照组不熏香烟,在模型组气管内注入PPE的同一天采用同一术式在气管内注入等量注射用生理盐水。模型制作成功后,以低于对照组大鼠平均体重的90%作为判断发生营养不良的标准,当COPD大鼠模型组营养不良发生率达到29%时,随机抽取已发生营养不良的大鼠10只,将动物分为对照组、COPD模型营养正常组、COPD模型营养不良非干预组和COPD模型营养不良TNF-αMcAb干预组。COPD模型营养不良TNF-αMcAb干预组尾静脉注射肿瘤坏死因子-α单克隆抗体(TNF-αMcAb) 0.1mg/Kg.Bw,其他组动物在相同时间尾静脉注射等量注射用生理盐水,干预4天,继续饲养10天后,处死全部大鼠,进行如下指标测定: 1)采用酶联免疫吸附实验(ELISA)测定大鼠血清、骨骼肌匀浆TNF-α含量。 2)使用自动生化仪测定大鼠血浆葡萄糖、白蛋白、甘油三酯含量。 3)分离大鼠膈肌、伸趾长肌,分别称重,匀浆后取上清液,采用高效液相色谱法(HPLC)测定上清液中三甲基组氨酸(3-MH)、酪氨酸(Tyr)含量。 结果: 1)大鼠血清TNF-α测定结果:COPD模型营养不良非干预组血清TNF-α含量明显高于对照组(P<0.01)、COPD模型营养正常组(P<0.01)和COPD模型营养不良干预组(P<0.01);COPD模型营养正常组血清TNF-α含量明显高于对照组(P<0.01)。 2)血浆葡萄糖、白蛋白、甘油三酯含量测定:COPD模型营养不良非干预组血浆葡萄糖、甘油三酯含量明显高于对照组(P<0.01,P<0.01)、COPD模型营养正常组(P<0.01,P<0.01)和COPD模型营养不良干预组(P<0.01,P<0.01);COPD模型营养不良非干预组血浆白蛋白含量明显低于对照组(P<0.01)、COPD模型营养正常组(P<0.01)和COPD模型营养不良干预组(P<0.01);COPD模型营养正常组血浆葡萄糖、甘油三酯含量明显高于对照组(P<0.01,P<0.01),COPD模型营养正常组血浆白蛋白含量则明显低于对照组(P<0.01)。 3)大鼠骨骼肌TNF-α测定结果:COPD模型营养不良非干预组膈肌、伸趾长肌匀浆TNF-α含量明显高于对照组(P<0.01,P<0.01)、COPD模型营养正常组(P<0.01,P<0.01)和COPD模型营养不良干预组(P<0.01,P<0.01);COPD模型营养正常组膈肌、伸趾长肌匀浆TNF-α含量明显高于对照组(P<0.01,P<0.01)。 4)大鼠膈肌、伸趾长肌称重结果:COPD模型营养不良非干预组大鼠膈肌、伸趾长肌重量明显低于对照组(P<0.01,P<0.01)、COPD模型营养正常组(P<0.01,P<0.01)和COPD模型营养不良干预组(P<0.01,P<0.01);COPD模型营养正常组膈肌、伸趾长肌重量明显低于对照组(P<0.01,P<0.01)。 5)大鼠膈肌、伸趾长肌匀浆中三甲基组氨酸(3-MH)、酪氨酸(Tyr)含量测定结果:COPD模型营养不良组大鼠膈肌、伸趾长肌匀浆中3-MH、Tyr含量均明显高于对照组(P<0.01,P<0.01,P<0.01,P<0.01)、COPD模型营养正常组(P<0.01,P<0.01,P<0.01,P<0.01)和COPD模型营养不良干预组(P<0.01,P<0.01,P<0.01,P<0.01);COPD模型营养正常组膈肌、伸趾长肌匀浆中3-MH、Tyr含量均明显高于对照组(P<0.01,P<0.01,P<0.01,P<0.01)。 6)COPD模型营养不良TNF-αMcAb干预组部分大鼠体重恢复到对照组体重的90%以上。血浆葡萄糖、白蛋白、甘油三酯与COPD营养正常组相比无统计学差异(P>0.05,P>0.05,P>0.05);膈肌、伸趾长肌重量与COPD营养正常组相比无统计学差异(P>0.05,P>0.05);膈肌、伸趾长肌3-MH、Tyr含量与COPD营养正常组相比无统计学差异(P>0.05,P>0.05,P>0.05,P>0.05)。 结论:TNF-α参与了COPD大鼠模型营养不良的发生。COPD大鼠模型骨骼肌蛋白质分解代谢率增高,与外周肌相比,呼吸肌蛋白质分解代谢率增高明显,且这种现象在COPD大鼠模型发生营养不良的大鼠表现更为明显。TNF-α是引起COPD大鼠发生营养不良和骨骼肌蛋白质分解代谢率增高的因素之一。 第二部分:探讨TNF-α引起COPD大鼠模型骨骼肌分解代谢率增高的作用机制 目的:建立COPD大鼠模型,对部分发生营养不良的大鼠采用TNF-αMcAb静脉注射进行干预,观察大鼠骨骼肌泛素-蛋白酶体途径主要成分:泛素mRNA,蛋白酶体20S C2亚基mRNA的表达以及骨骼肌TNF-αmRNA的表达。探讨TNF-α引起COPD大鼠模型骨骼肌分解代谢率增高的作用机制。 方法: 1、同第一部分方法建立COPD大鼠模型。 2、同第一部分进行分组及干预后,采用RT-PCR半定量测定大鼠膈肌、伸趾长肌TNF-αmRNA,泛素mRNA,蛋白酶体20S C2亚基mRNA的表达。 结果: 1)大鼠骨骼肌TNF-αmRNA测定结果:COPD模型营养不良非干预组膈肌、伸趾长肌TNF-αmRNA表达明显高于对照组(P<0.01,P<0.01)、COPD模型营养正常组(P<0.01,P<0.01);COPD模型营养正常组膈肌、伸趾长肌TNF-αmRNA表达明显高于对照组(P<0.01,P<0.01)。 2)大鼠骨骼肌泛素mRNA,蛋白酶20S C2亚基mRNA的表达测定结果:COPD模型营养不良非干预组膈肌、伸趾长肌泛素mRNA,蛋白酶体20S C2亚基mRNA的表达明显高于对照组(P<0.01,P<0.01,P<0.01,P<0.01)、COPD模型营养正常组(P<0.01,P<0.01,P<0.01,P<0.01)和COPD模型营养不良干预组(P<0.01,P<0.01,P<0.01,P<0.01);COPD模型营养正常组膈肌、伸趾长肌泛素mRNA,蛋白酶体20S C2亚基mRNA的表达明显高于对照组(P<0.01,P<0.01,P<0.01,P<0.01)。 3) COPD模型营养不良TNF-αMcAb干预组膈肌、伸趾长肌TNF-αmRNA表达与COPD模型营养不良非干预组相比无统计学差异(P>0.05,P>0.05),泛素mRNA,蛋白酶体20S C2亚基mRNA表达则明显低于COPD模型营养不良非干预组(P<0.01,P<0.01,P<0.01,P<0.01)以及COPD模型营养正常组(P<0.01,P<0.01,P<0.01,P<0.01)。 结论: 泛素-蛋白酶体途径是COPD大鼠模型骨骼肌蛋白质降解的重要途径;泛素.蛋白酶体途径活性增高可能是TNF-α引起COPD大鼠模型骨骼肌蛋白质高分解代谢的机制。


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