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RhoA/ROCK信号通路在TGF-β1诱导的大鼠腹膜间皮细胞转分化中的作用

刘小贤  
【摘要】: 目的:探讨RhoA/ROCK信号通路在TGF-β1诱导的大鼠腹膜间皮细胞(RPMCs)转分化中的作用。 方法:(1)采用腹腔注射胰蛋白酶法,分离培养SD大鼠原代腹膜间皮细胞,经倒置相差显微镜和免疫组织化学染色(Immunohistochemistry,IHC)鉴定;(2)常规传代,取第二代腹膜间皮细胞用于实验,培养的细胞静止24h后,随机分为正常对照组和TGF-β1(10ng/ml)刺激组两组,分别用半定量RT-PCR、Western Blot和间接免疫荧光(Immunofluorescence,IF)法观察不同时间α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA),E-钙黏蛋白(E-cadherin)、胶原Ⅰ(CollagenⅠ)、波形蛋白(Vimentin)以及RhoA(包括总RhoA及活化的RhoA)mRNA和/或蛋白的表达;(3)取第二代融合后的腹膜间皮细胞,静止24h后随机分为以下4组:正常对照组,TGF-β1(10ng/ml)刺激组,TGF-β1(10ng/ml)+Y-27632(ROCK特异性抑制剂,10μM)组,Y-27632(10μM)组,分别用半定量RT-PCR、Western Blot和间接免疫荧光法检测E-cadherin、α-SMA、CollagenⅠ、Vimentin mRNA和蛋白表达。 结果:(1)经鉴定,95%以上的培养细胞为RPMCs。(2)半定量RT-PCR显示,TGF-β1刺激组E-cadherin mRNA表达水平与对照组比呈时间依从性减弱(12h、24h、48h P<0.05);α-SMA和CollagenⅠmRNA表达水平均呈时间依从性增加,其中α-SMA mRNA表达水平从6h开始与对照组比均增加(P<0.05),24h达高峰,之后减弱;CollagenⅠmRNA表达水平从12h开始与对照组比均增加(P<0.05),其中24h达高峰,较对照组显著增加(P<0.01),之后减弱。Western Blot和IF均显示,TGF-β1刺激组E-cadherin蛋白表达从24h起与对照组比明显减少(P<0.05),α-SMA、CollagenⅠ及Vimentin蛋白表达呈时间依从性表达上调,在24h、48h与对照组比有统计学差异(P<0.05)。外源性TGF-β1刺激RPMCs能诱导RhoA活化,于10分钟开始出现活性升高,是对照组的(2.57±0.52)倍(P<0.05),1小时达高峰,是对照组的(4.35±0.41)倍(P<0.05),之后活化RhoA的表达逐渐减弱。(3)半定量RT-PCR、Western Blot和IF分别显示,TGF-β1+Y-27632组E-cadherin mRNA和蛋白表达水平较TGF-β1刺激组无增加(P>0.05),α-SMA和CollagenⅠmRNA表达水平较TGF-β1刺激组各降低了25.4%和55.7%(P<0.05),α-SMA、Vimentin和CollagenⅠ蛋白表达水平较TGF-β1刺激组分别降低了30.0%、60.3%和58.1%(P<0.05)。 结论:(1)外源性TGF-β1诱导大鼠腹膜间皮细胞发生EMT并上调活性RhoA的表达;(2)RhoA/ROCK通路选择性抑制剂Y-27632下调TGF-β1诱导的α-SMA、CollagenⅠ和Vimentin表达,抑制EMT,但对E-cadherin没有影响;(3)TGF-β1可通过RhoA/ROCK信号通路介导大鼠腹膜间皮细胞转分化,抑制该通路可作为防治腹膜纤维化的潜在靶点。


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