Angiopoietin-1对糖尿病小鼠心肌缺血损伤的保护作用及机制研究

【摘要】： 【高血糖对小鼠心肌组织Ang/Tie-2系统的影响和对心肌缺血损伤的作用】 糖尿病患者的心血管病死亡率明显高于非糖尿病患者。心肌缺血诱导的新生血管形成功能在糖尿病患者身上明显下降,是导致糖尿病患者心血管疾病猝死的一个重要原因。文献报道Angiopoietin(Ang)/Tie-2系统与糖尿病性肾病或糖尿病性视网膜病的新生血管形成都密切相关,并且Ang-2/Ang-1比值上调程度与冠心病的严重程度还呈正相关,但关于这一系统与糖尿病患者的心血管疾病的关系研究很少。 我们在STZ诱导的糖尿病小鼠模型上观察心肌缺血对Ang/Tie-2系统的影响。首先结扎小鼠心肌冠状动脉左前降支,造成急性心肌缺血模型,Western-Blot的结果显示:与正常小鼠相比,STZ诱导的糖尿病小鼠心肌Ang-2蛋白明显增加,Tie-2表达下降,Ang-1蛋白没有变化;STZ小鼠心肌Ang-2/Ang-1的比率明显上调;缺血诱导Tie-2表达上调现象在STZ小鼠组被削弱,并且Ang-1/Tie-2信号通路的下游底物AKT,可以被缺血诱导活化的现象也在STZ小鼠心肌消失。然后,我们用TTC染色法观察缺血心肌梗死面积,用Tunel法和Caspase3免疫组化法检测缺血心肌凋亡,发现:STZ小鼠左室梗死面积是正常缺血小鼠的1.6倍,缺血区心肌细胞凋亡率也显著超过正常小鼠缺血区域。这些充分说明糖尿病引起Ang/Tie-2系统失平衡,心肌缺血损伤也加重。 Ang是一个与血管新生密切相关的家族。Ang-2和Ang-1都是Tie-2的天然配体,Ang-1能增进血管内皮细胞Tie-2的磷酸化,进而促进血管成熟和稳定。Ang-2可以竞争性结合Tie-2阻止Ang-1的活化功能。我们为了观察Ang/Tie-2系统改变引进的血管形成变化,运用免疫荧光染色检测持续缺血2周后各组心肌毛细血管和微动脉的数目。我们的结果显示STZ小鼠心肌缺血后毛细血管密度以及微动脉数目与糖尿病假手术组没有什么差异,而正常小鼠心肌缺血2周后,毛细血管和微动脉数目都升高近1.5倍。同时,与新生血管形成相伴随的代偿性心肌肥厚现象在正常缺血小鼠组表现明显,STZ小鼠组虽然也出现心肌肥厚,但明显要弱于正常小鼠组。提示糖尿病可能通过引起Ang/Tie-2系统失平衡,而抑制缺血诱导的新生血管形成。 【Ang-1保护高糖环境下的心肌缺血损伤】 为了下调Ang-2/Ang-1的比值,纠正Ang/Tie-2系统的失平衡现象,我们给糖尿病小鼠尾静脉注射Ang-1腺病毒,以腺病毒空载体注射的糖尿病小鼠组为平行对照,2天后做心肌缺血手术,急性缺血24小时后观察Ang-1对心肌保护因子AKT、心肌梗死面积、心肌细胞凋亡的影响。结果显示Ang-1可以促进糖尿病小鼠心糀KT活化,缩小心肌梗死面积,还拮抗心肌细胞凋亡。同时,我们还给正常野生型小鼠注射Ang-2腺病毒载体,观察到Ang-2可以进一步扩大心肌缺血梗死面积,初步证实Ang-1通过纠正糖尿病小鼠Ang-2/Ang-1的不平衡,拮抗Ang-2的作用而保护糖尿病小鼠心肌缺血。 我们还观察了缺血2周后Ang-1对心肌新生血管形成和心肌肥厚的影响,发现Ang-1可以增加糖尿病小鼠心肌微动脉和毛细血管数目,促进血管形成和冠脉侧支循环发展,利于心肌缺血的恢复,同时,糖尿病小鼠代偿性心肌肥厚增加。综上所述,进一步证实Ang-1可以保护高糖环境下的心肌缺血损伤。 【Ang-1拮抗高糖环境下微血管内皮细胞凋亡而保护缺血心肌】 微血管内皮功能紊乱在心脏缺血损伤中扮演一个关键的角色,而高血糖是引起微血管内皮功能紊乱的确切因子。流行病学资料显示糖尿病患80%死于心脏微血管并发症。故保护微血管内皮细胞对维护心脏功能具有重要意义。 我们用高糖培养基孵育微血管内皮细胞3天后,与正常糖培养基中细胞比较,观察到高糖环境下,微血管内皮细胞Ang-2表达增加,Ang-1/Tie-2/AKT/eNOS信号通路下调,并对无血清培养基诱导的凋亡敏感;Ang-1的介入可以拮抗Ang-2而竞争性地结合并激活Tie-2,启动下游信号分子AKT,甚至于eNOS。由于Ang-1/Tie-2信号通路激活,高糖内皮细胞对无血清培养基的耐受能力也增加。我们用MTT法检测细胞活性、Tunel法观察凋亡核形态、酶联免疫试验和Western Blot法分析凋亡或存活蛋白的活性,发现:Ang-1可以增加高糖内皮细胞活性,抑制凋亡蛋白Caspase3活化,增加存活蛋白Survivin表达;同时,降低高糖内皮细胞凋亡率。证实Ang-1对糖尿病性心肌缺血的保护作用可以通过拮抗高糖微血管内皮细胞凋亡而产生。 【Ang-1促进高糖环境下血管形成而保护缺血心肌】 血管形成有两种重要模式:新生血管形成(Angiogenesis)和血管发生(Vasculogenesis)。Angiogenesis的主要方式是内皮出芽(endothelialsprouting)。内皮细胞出芽依赖于内皮细胞迁移、增殖和管腔样结构形成。为研究Ang-1对内皮细胞出芽的作用,我们把高糖孵育的细胞种植在ECM胶中生长,观察到高糖可以抑制内皮细胞管腔样结构形成,而Ang-1显著促进高糖细胞形成管腔样结构,尤其是Ang-1腺病毒转染的高糖细胞组形成管腔样结构的数目甚至超过正常糖浓度组。我们还设计动脉环出芽实验来检测动脉内皮的迁移增殖能力,观察到高糖环境下血管环的内皮由于迁移、增殖能力下降而出芽减少;Ang-1处理的高糖内皮细胞出芽显著增多。进一步证实Ang-1可以促进高糖环境下微血管内皮细胞新生血管形成,也说明Ang-1通过增加内皮出芽来促进糖尿病心肌血管形成,从而保护心肌缺血。 成年后的Vasculogenesis主要指内皮祖细胞(EndothelialProgenitor Cells,EPC)迁移到心肌通过自身的分化、增殖而形成新生血管,无需依赖原有的血管系统。文献报道缺血可以诱导EPC功能加强,但在糖尿病患者身上受到抑制。我们用Ang-1注射糖尿病惺?然后体外培养骨髓干细胞,用成熟内皮抗原CD31~+标记EPC,发现Ang-1可增加EPC数目,促进糖尿病小鼠骨髓干细胞向内皮细胞分化。也就提示Ang-1通过增加小鼠骨髓源性EPC来增进糖尿病心肌血管形成,从而保护心肌缺血。 综上所述,Ang-1通过促进高糖环境下血管形成而保护糖尿病小鼠心肌缺血。 【Ang-2削弱Ang-1对高糖环境下内皮细胞的保护作用】 Ang-2是在1997年被Masionpierre作为内皮细胞Tie-2受体的阻断剂发掘,关于Ang-2是内皮细胞的保护性因子还是对立面,一直有许多争议。我们的实验结果显示:外源性Ang-2的加入加重高糖环境下的内皮细胞损伤,Ang-2干扰可以抑制高糖环境下内皮细胞的凋亡;如果把外源性Ang-2和Ang-1一并加入高糖细胞,Ang-1拮抗高糖环境下内皮细胞凋亡的作用被削弱,并且促高糖内皮细胞管腔样结构形成的能力也降低,结合高糖环境下Ang/Tie-2系统的变化,因此我们认为Ang-1是通过拮抗Ang-2而发挥微血管内皮细胞保护作用。总之,Ang/Tie-2信号系统对于糖尿病性心脏病的发生发展机理研究具有很高的科研价值,尤其是深入对蛋白Ang-1功能及作用机制的研究,将为糖尿病患者心肌缺血性疾病的治疗提供极具优势的理论和实验依据。