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无机抗菌复合材料的制备、抗菌活性及其抗菌机理研究

黄勋  
【摘要】: 研究目的 光催化型无机抗菌材料依赖光致激发的强氧化自由基而起杀菌作用。其中氧化钛不仅具有光催化活性高、抗菌速度快、热稳定性好、长期有效、价格低及对人体无害等特点,而且能分解内毒素,具有净化、自洁、除臭和驱除氧化氮等功能,因而成为最受关注的一种光催化型无机抗菌材料,也是目前无机抗菌材料领域最为活跃的一个研究方向。但由于氧化钛禁带较宽,对光特别是可见光的利用率较低,单独使用时需要近紫外光的照射下才能充分体现出来,具有有限性,导致应用领域受到极大的限制。因此对氧化钛进行修饰从而提高其抗菌活性及拓展应用领域已成为近年来国内外学者研究的热点。本课题立足于研究开发具有良好的抗菌活性的无机纳米抗菌复合材料,采用溶胶—凝胶法制备出纳米氧化钛溶胶溶液、掺铁纳米氧化钛溶胶溶液、掺镧纳米氧化钛溶胶溶液,用冷冻干燥的方法干燥成干凝胶粉,在不同温度下煅烧生成纳米粉末,评估了所有样品对金黄色葡萄球菌ATCC 6538、大肠埃希菌ATCC 8099以及铜绿假单胞菌ATCC 15442的抗菌活性,对最佳抗菌活性的样品的抗菌机理、抗菌影响因素、抗菌稳定性以及安全性等方面进行了探讨。 研究方法 1、采用溶胶—凝胶法制备出纯纳米氧化钛和掺铁纳米氧化钛、掺镧溶胶纳米氧化钛溶液,用冷冻干燥的方法干燥成干凝胶粉,在不同的温度下煅烧生成18种纳米粉末。采用扫描电镜和能谱仪对获取的纳米粉末结构进行表征。 2、选择金黄色葡萄球菌ATCC 6538、大肠埃希菌ATCC 8099、铜绿假单胞菌ATCC 15442为代表;采用三角烧瓶振荡试验法测定了18种样品中最佳抗菌活性的样品;用试管法测定了具有最佳抗菌活性材料对上述细菌的最低抑菌浓度与最低杀菌浓度。 3、初步探讨了最佳抗菌活性的纳米复合抗菌材料的抗菌机理。比较紫外光照射与避光条件下的抗菌活性不同,探讨除存在光催化氧化机理外,是否存在其他抗菌机理。实验中采用光学显微及电子显微镜观察该样品作用后不同时间细菌菌体外观及超微结构的变化。采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法检测材料作用前后是否有菌体蛋白的变化。 4、选择金黄色葡萄球菌ATCC 6538、大肠埃希菌ATCC 8099、铜绿假单胞菌ATCC15442等三种细菌为代表,通过更改暴露方式、作用时间、细菌生长代数、加入样品中的细菌含量、溶液pH值和有机物干扰等各种因素,研究该纳米复合抗菌材料抗菌活性的影响因素。 5、选择金黄色葡萄球菌ATCC 6538、大肠埃希菌ATCC 8099为代表,比较临时配置、配置两个月、配置四个月以及配置六个月的样品对菌株抗菌活性。了解该纳米复合抗菌材料可以连续对几代细菌产生作用。用亚抑菌浓度材料连续10代消毒金黄色葡萄球菌ATCC653、大肠埃希菌ATCC8099,对比10代菌株毒力变化、生化变化、细菌药敏谱变化;同时用亚抑菌浓度材料连续10代消毒临床菌株XY449、XY366,分析10代菌株质粒图谱变化。 6、采用最低抑菌浓度5倍量进行急性皮肤刺激实验检测该纳米抗菌复合材料对实验动物皮肤的刺激/腐蚀作用和强度;通过急性经口毒性试验检测纳米抗菌复合材料对实验动物的急性毒性作用和强度;通过小鼠骨髓细胞微核试验检测纳米抗菌复合材料对小鼠骨髓细胞微核形成的影响,以此评估该纳米抗菌复合材料的安全性。 研究结果 1、由扫描电镜和能谱仪测定结果可知,通过溶胶凝胶法获取的材料全部为纳米级且不含杂质。 2、样品1、2、10、12、18对三种细菌基本无抗菌活性,其余各样品对不同的细菌均存在不同程度的抗菌活性。掺杂稀土金属镧的13号材料(代号FH1号)抗菌活性最强。13号样品对ATCC6538、ATCC8099以及ATCC15442的最低抑菌浓度分别为12.5mg/ml、25mg/ml、25mg/ml;最低杀菌浓度分别为25mg/ml、50mg/ml、50mg/ml。 3、通过光学显微镜可以发现与FH1号接触后金黄色葡萄球菌的典型葡萄状结构发生改变,单个细菌间的联接发生断裂;大肠埃希菌数量明显减少,细菌细胞外观肿胀,有吞饮现象出现。通过电子显微镜,可以发现细菌数量明显减少,细胞壁出现凹凸不平,细胞肿胀、固缩或坏死,胞质减少,菌体表面电子密度增高。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳法发现细菌菌体蛋白在接触前后发生改变。 4、FH1号在无紫外光照与有紫外光照射时同样具有较好的抗菌活性;作用时间越长抗菌效果越好;细菌浓度越高,材料浓度要求越高;静止期细菌杀灭率较繁殖期细菌弱,处于稳定生长期的细菌要比处于对数生长期的细菌难失活;pH值在5-9的范围,对FH1号的杀菌作用无影响;有机物对灭菌效果的影响较大。 5、临时配置、配置两个月、配置四个月和配置六个月的FH1号对金黄色葡萄球菌与大肠埃希菌的最低抑菌浓度与最低杀菌浓度无差异。在抑菌浓度下,连续加入金黄色葡萄球菌ATCC6538 6代后FH1号对细菌的抗菌活性明显下降,细菌杀灭率由最初的96%下降到67%(P<0.05),而在抑菌浓度下,连续加入大肠埃希菌ATCC8099 5代后FH1号对细菌的抗菌活性也有所下降。用亚抑菌浓度连续消毒10代后,实验大肠埃希菌从第四代开始生化反应管中鸟氨酸与棉子糖发生变化,细菌药敏谱无变化、质粒图谱无明显变化,金黄色葡萄球菌从第八代开始生化反应管中尿素实验阳性时间发生延长,血浆凝固酶实验均为阳性,细菌药敏谱无变化,临床菌株的质粒图谱无明显改变。 6、一次完整皮肤刺激试验计数为0,一次破损皮肤刺激试验计数为0.5,结果提示FH1号属于无刺激性材料。一次最大限度试验结果显示FH1号在5000mg/kg实验条件下,所有受试动物均没有死亡,提示为实际无毒材料。实验结果表明本试验中三种不同剂量组纳米抗菌复合材料对小鼠骨髓细胞微核率变化无影响。 研究结论 1、通过溶胶凝胶法获取的无机复合材料全部为纳米级且不含杂质。 2、样品1、2、10、12、18对金黄色葡萄球菌ATCC6538、大肠埃希菌ATCC8099、铜绿假单胞菌ATCC15442无抗菌活性;样品13(纳米掺镧氧化钛材料,代号FH1)抗菌活性最强。 3、FH1在避光与紫外线照射下抗菌活性无显著性差异。抗菌活性与作用时间、细菌浓度、细菌生长状态、pH值以及有机物的影响有关。稳定性较强,连续使用6次后抗菌活性有降低,亚抑菌浓度连续消毒细菌药敏谱无变化、质粒图谱无明显变化,血浆凝固酶结果无变化,仅少量生化反应发生变化。属于无刺激性、实际无毒材料。对小鼠骨髓细胞微核率的升高无影响。 4、FH1抗菌机理除光催化机理外,尚存在稀土金属接触与稀土金属离子溶出机制;抗菌过程中,细菌外观及超微、菌体蛋白均发生变化。


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