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一个人类睾丸特异表达新基因-septin 12 transcript variant 2的克隆与功能初步研究

汪金荣  
【摘要】: 不育影响着大约10-15%的夫妻,不育的原因夫妻双方约各占一半。遗传因素是男性不育的一个重要因素,男性不育患者染色体检查常常发现有基因缺失、突变或易位。因此生精相关基因的研究对男性不育的诊断和治疗有着重要的意义。精子的发生是一个非常复杂而又受到精确调控的过程,分为有丝分裂阶段、减数分裂阶段和减数分裂后阶段,其中涉及一系列基因的调控,人类的研究表明有2000个以上的基因参与了生精过程,而参与这一过程的蛋白质更多。 随着人类基因组计划(Human Genome Project,HGP)的实施和生物技术的飞速发展,人类基因组测序数据呈指数增长,各种生物数据库及其分析软件相应建立,极大地促进了生物信息学的发展。利用生物信息学克隆新基因和分析基因功能已成为生物信息学研究的热点,大量的新基因被克隆,其中包括不少生精相关基因。本课题尝试利用生物信息学方法寻找新的生精基因,并对其功能进行预测和初步研究,分析该基因在精子生成过程中的作用,有助于进一步了解精子发生的分子机制。 第一章:睾丸特异表达新基因的克隆 精子的生成是一个受多基因调控的过程,目前已发现一系列与精子发生相关的基因,但仍有许多未知基因涉及精子的发生,精子发生与调控的机制仍未阐明。利用生物信息学方法发现新基因是寻找新基因的一条捷径,我们尝试通过数据库消减杂交(DigitalDifferential Display,DDD)方法发现一新的睾丸特异表达基因,并以RT-PCR实验验证。 以因特网UniGene数据库的人类各组织cDNA文库为实验材料,以DDD软件为工具,比较人类睾丸组织和其它组织的cDNA文库,筛选出在睾丸组织中显著高表达并可能代表新基因的的克隆重叠群,将获得的克隆重叠群内的EST(expressed sequence tag)进行同源搜索、拼接和延伸,得到一较长的新基因序列。根据新基因序列设计引物进行PCR反应验证序列拼接是否正确及新基因的真实性。 通过数据库消减杂交(DDD),找到一个在睾丸组织cDNA文库和非睾丸组织cDNA文库中显著差异表达的克隆重叠群Hs.126780,生物信息学分析显示其在睾丸组织中高表达。Hs.126780重叠群包括39条EST,将EST进行拼接、延伸后获得一个新的基因序列,长为1524bp,其中包含一个完整的阅读框架,长1077 bp,编码一358氨基酸的蛋白质,新基因有10个外显子和9个内含子。PCR反应并测序证实新基因序列拼接正确,且在人类睾丸组织中表达。利用生物信息学克隆睾丸特异表达新基因是一种切实可行、高效的新方法,我们运用该方法成功地克隆了一个人类睾丸特异表达新基因,将新基因序列向GenBank数据库提交并被收录,经人类基因命名委员会(Human GeneNomenclature Committee,HGNC)命名为:septin 12 transcriptvariant 2,基因登陆号为:DQ517531。 第二章:新基因及其编码蛋白质的生物信息学分析 在对新基因(septin 12 transcript variant 2)的功能进行研究前我们先利用网络上各种生物学软件,对新基因及其编码的蛋白质进行分析和预测,初步了解新基因的一些特性,为后继的研究提供指导。 利用NCBI的Blast程序对新基因及编码蛋白质进行同源性分析;以BLAST Human Sequences程序进行电子染色体定位;以BioEdit7.0.1软件分析新基因的酶切位点;运用PSORTⅡ软件预测蛋白质细胞内定位;运用ExPASy网站的多个软件对新基因编码蛋白质的理化性质、跨膜区和信号肽序列、疏水性,功能位点进行分析和预测。 生物信息学分析显示新基因与Septin家族多个成员的基因和蛋白质序列有同源性,属于Septin家族基因,该基因无EcoRI、SalI和XhoI酶切位点,基因定位于人类染色体16p13.3,其编码蛋白质的氨基酸序列为358个,分子量为40747D,等电点为6.67。蛋白质细胞内定位:线粒体(可能性为56.5%);胞浆(可能性为17.4%)。无明显跨膜序列和信号肽,推测为非分泌蛋白,有多个磷酸化位点和其它翻译后修饰位点。 第三章:新基因功能的初步研究 基因研究的最终目的是了解其功能,我们进行了多组织RT-PCR(multi-tissue RT-PCR)、Northern印迹杂交(Northern Blots)和原位杂交(in situ hybridization)实验,对新基因的组织表达谱和功能进行了初步研究,并构建了新基因的真核表达载体。 多组织RT-PCR和Northern印迹杂交结果显示新基因在成年男性睾丸组织中高表达,在其它组织中不表达;胎儿除睾丸组织外,在其它少数组织中有微弱表达。新基因在成年睾丸组织中表达最强,在老年睾丸组织中表达减弱,在胎儿睾丸组织中低表达或不表达,在隐睾组织中不表达。新基因在睾丸组织中只表达一个转录本。睾丸组织的原位杂交结果与多组织RT-PCR和Northern印迹杂交结果一致,原位杂交显示新基因主要在精原细胞和精母细胞中表达。 初步研究表明新基因为一睾丸特异表达基因,主要表达于睾丸的精原细胞和精母细胞,其表达与发育阶段有关。新基因的功能可能与精子发生相关,可能参与生精细胞的生长、发育和调亡的调控。 结论:本研究利用生物信息学这一新策略成功克隆了一个人类睾丸特异表达新基因:sept in 12 transcript variant 2,并采用RT-PCR、Northern印迹杂交和原位杂交实验对新基因的表达特征和功能进行初步研究。我们认为新基因在人类精子发生的过程中可能发挥着重要的作用,是一个生精相关基因,具有重要的生理功能。


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