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局部人工脑脊液灌洗治疗大鼠重型颅脑损伤的实验研究

姜交德  
【摘要】: 背景和目的:本课题组此前进行了局部人工脑脊液灌洗、局灶亚低温对脑外伤后脑水肿、细胞凋亡的影响的研究;证实了人工脑脊液灌洗对脑外伤的疗效及对神经细胞凋亡的调节作用。但是,人工脑脊液灌洗对正常脑组织是否存在损伤、灌洗持续时间对疗效的影响、人工脑脊液灌洗调节神经细胞凋亡的具体机制尚未阐明;而且其疗效在动物临床水平上未得到验证。本实验通过重型颅脑损伤干预后检测不同时间点的脑组织水含量、钠钾离子及EB含量、细胞凋亡、VEGF、P-ERK2、TNF-a蛋白的表达、光镜电镜观察及实验动物临床神经功能障碍评估来研究以下几点:①局部人工脑脊液灌洗对正常脑组织有无损伤。②局部人工脑脊液灌洗持续时间对疗效的影响。③局部人工脑脊液灌洗调节细胞凋亡的可能机制。④局部人工脑脊液灌洗对大鼠病死率、神经功能障碍的影响。以期为人工脑脊液的临床应用提供更多的实验及理论依据。 第一部分局部人工脑脊液灌洗对大鼠正常脑组织有无损伤的实验研究 方法:健康成年SD大鼠77只,随机分为正常组(N组)、假手术组(SO组)、生理盐水灌洗组(NS组)、人工脑脊液灌洗组(ACF组),又按大鼠处死时间分为术后12小时、3天两个亚组,每亚组6只大鼠,对照组6只,各组大鼠于各时间段处死后分别行脑组织水含量、钠、钾含量及电镜的检测。另亚组5只行伊文思蓝检测。 结果:1.脑组织含水量、离子含量及伊文思蓝含量:正常脑组织人工脑脊液灌洗后12小时、3天脑组织含水量、钠离子、钾离子及伊文思蓝含量与对照组、假手术组比较无显著差异(P>0.05)。生理盐水灌洗后12小时、3天脑组织含水量、钠离子及伊文思蓝含量均高于对照组、假手术组,人工脑脊液灌洗组,钾离子则相反。2.病理改变:假手术组、人工脑脊液灌洗组在各时间点毛细血管周围无水肿、神经元及胶质细胞无异常;生理盐水灌洗组可见神经元、胶质细胞内及周边轻度水肿,核膜变薄;线粒体及微血管内皮轻度肿胀。 结论:1.人工脑脊液灌洗在保持合适的滴速下对正常脑组织无损伤。 2.生理盐水灌洗对正常脑组织造成一定程度的损伤。 第二部分脑外伤后局部人工脑脊液灌洗持续时间对疗效的影响 方法:健康成年SD大鼠240只,随机分为5组,即假手术组(SO组)、脑外伤模型组(TBI组)、人工脑脊液灌洗3小时组(FI_(3h)组)、人工脑脊液灌洗6小时组(FI_(6h)组)、人工脑脊液灌洗9小时组(FI_(9h)组);各组又按处死时间即伤后12h、1d、3d、7d分为4个亚组,每亚组6只行水含量、钠、钾含量与电镜检测;另每亚组6只行免疫组化检测VEGF蛋白的表达。 结果:1.脑组织水含量、钾钠离子含量及VEGF蛋白灰度值:TBI组、FI_(3h)组、FI_(6h)组、FI_(9h)组伤后12小时即开始出现脑组织水肿,第一天达脑水肿高峰,持续至第3天,与SO组比较有显著差异(P<0.05);第7天降至SO组水平(P>0.05)。伤后12小时、1天、3天FI_(3h)组、FI_(6h)组、FI_(9h)组含水量均低于TBI组(P<0.05);FI_(6h)组含水量低于FI_(3h)组(P<0.05);FI_(9h)组含水量低于FI_(6h)组(P<0.05)。钠离子含量及VEGF灰度值与水含量变化趋势一致,钾离子含量与上述改变相反。2.病理学检查:电镜下发现TBI组神经细胞水肿明显,线粒体肿胀、血脑屏障破坏,FI_(3h)组、FI_(6h)组、FI_(9h)组均有不同程度的减轻。 结论:1.局部人工脑脊液灌洗能够抑制VEGF蛋白表达。 2.延长局部人工脑脊液灌洗时间能够减轻脑水肿。 第三部分局部人工脑脊液灌洗通过ERK通路对重型颅脑损伤后神经细胞凋亡的影响 方法:健康成年SD大鼠192只,随机分为4组,即假手术组(SO组)、脑外伤模型组(TBI组)、局部人工脑脊液灌洗组(ACF组)、局部生理盐水灌洗组(NS组);各组又按处死时间即伤术后6h、12h、1d、3d分为4个亚组,每亚组6只行蛋白免疫印记(western blot)检测;另每亚组6只检测细胞凋亡及免疫组化。 结果:1.P-ERK2蛋白表达:TBI组、ACF组、NS组伤后6小时表达增加,12小时到达高峰,第1天下降,第3天仍高于SO组(P<0.05)。在各时间点P-ERK2蛋白表达的关系为ACF组<NS组<TBI组(P<0.05)。2.TNF-a蛋白的表达:TBI组、ACF组、NS组伤后6小时表达增加,1天到达高峰,第3天仍高于SO组(P<0.05)。在各时间点TNF-a蛋白表达的关系为ACF组<NS组<TBI组(P<0.05) 3.脑组织细胞凋亡:SO组脑组织TUNEL阳性细胞数很少;脑外伤各组脑组织TUNEL阳性细胞数于伤后6小时明显高于SO组(P<0.05、),于伤后第一天达高峰,第3天仍明显高于SO组(P<0.05)。在各时间点TUNEL阳性细胞数的关系为ACF组<NS组<TBI组(P<0.05)。 结论:1.局部人工脑脊液灌洗通过外源性的ERK通路抑制神经细胞凋亡。 2.局部人工脑脊液抑制细胞凋亡的作用要强于局部生理盐水灌洗。 第四部分局部人工脑脊液灌洗对大鼠重型颅脑损伤后死亡率、神经功能障碍的影响 方法:健康成年SD大鼠36只,随机分为3组,即假手术组(SO组)、脑外伤模型组(TBI组)、局部人工脑脊液灌洗组(ACF组),每组12只,分别于术后1d、3d、7d、14d、28d检查每组大鼠的神经功能障碍评分(Modified neurological Severity Scores;mNSS评分);于伤后1d、3d、7d、14d、28d利用平衡木行走实验(Beam walking testBWT)来评估大鼠的精细运动和协调能力;爬坡实验(angling test)用于检测大鼠的四肢肌力变化。并于伤后7d统计TBI组、ACF组大鼠的死亡率。 结果:1.mNSS评分:TBI组伤后神经功能障碍严重(mNSS评分高),以后逐步恢复,14天后神经功能基本恢复正常;ACF组在伤后3d、7d mNSS评分较TBI组低(P<0.05),1d、14d、28d无明显差异(P>0.05)。2.BWT时间:TBI组、ACF组伤后1d、3d、7d、14d行走时间延长,与术前、SO组比较有显著差异(P<0.05),28天后与术前、SO组比较无明显差异(P>0.05)。其中ACF组在3d、7d、14d行走时间延长少于TBI组(P<0.05);而在伤后1d、28d比较无显著差异(P>0.05)。3.爬坡实验:TBI组、ACF组伤后1d、3d、7d、14d爬坡角度变小,与术前、SO组比较有显著差异(P<0.05),伤后1d、28天与术前、SO组比较无明显差异(P>0.05)。其中ACF组在3d、7d、14d爬坡角度大于TBI组(P<0.05),而在伤后1d、28d比较无显著差异(P>0.05)。4.死亡率:伤后7天ACF组死亡率与TBI组比较无统计学差异(P>0.05). 结论:局部人工脑脊液灌洗能够促进大鼠外伤后神经功能障碍的恢复。


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