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细胞色素C氧化酶Ⅱ亚基甲基化在慢性阻塞性肺疾病肺血管内皮细胞凋亡中的作用

杨敏  
【摘要】: 第一章COPD肺血管内皮细胞凋亡和COX表达与功能的改变及其发生机制初探 目的:观察COPD患者肺组织中血管内皮细胞凋亡、COX功能和COXⅡ表达变化,探讨COPD可能的发病机制。 方法:2007年9月至2008年5月在中南大学湘雅二医院胸外科行肺切除术的周围型肺癌患者病例20例,根据COPD诊断标准和WHO吸烟调查方法标准将其分成3组:A组(非吸烟非COPD组),7例;B组(吸烟非COPD组),7例;C组(吸烟并COPD组),6例。TUNEL法检测肺血管内皮细胞凋亡指数,分光光度法检测COX活性,普通RT-PCR和荧光RT-PCR(RQ-PCR)检测COXⅡmRNA表达,以及免疫组织化学和WB法检测COXⅡ蛋白的分布和表达。使用SPSS 13.0统计软件进行数据分析,正态分布的各组计量资料以(?)±s表示,多组间比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA),变量间采用单因素相关分析(Pearson),P<0.05差异有统计学意义。 结果:C组肺血管内皮细胞凋亡指数[(13.8±1.9)%]较B组[(9.6±0.8)%]和A组[(5.9±1.0)%]均增高,任意两组间差异均有统计学意义(均P<0.05)。A组COX活性、COXⅡmRNA的ΔΔCt值和COXⅡ蛋白OD值分别为(7.6±0.4)×10~(-1)U/mg、(0.86±0.20)和(0.99±0.14);B组分别为(6.0±0.6)×10~(-1)U/mg、(0.8±0.15)和(0.81±0.09);而C组分别为(4.4±0.7)×10~(-1)U/mg、(0.76±0.17)和(0.60±0.07),各变量在A、B、C三组中依次下降,任意两组间差异有显著性(均P<0.05)。经相关性分析,细胞凋亡指数与FEV_1/Pre呈负相关(r=-0.846,P<0.01),与吸烟指数正相关(r=0.794,P<0.01)。COX活性与FEV_1/Pre呈正相关(r=0.842,P<0.01),与吸烟指数负相关(r=-0.783,P<0.01)。 结论:(1)COPD患者肺血管内皮细胞凋亡。(2)COPD患者肺组织COXⅡ表达抑制并且COX活性下降。(3)吸烟可能与肺血管内皮细胞凋亡、COXⅡ表达抑制及COX活性下降有关。(4)COX可能介导COPD肺血管内皮细胞凋亡。 第二章COPD患者COXⅡ的甲基化状态及其与COPD的关系 目的:探讨COPD患者COXⅡ甲基化状态及其与COPD的关系。 方法:2007年9月至2008年5月在中南大学湘雅二医院胸外科行肺切除术的周围型肺癌患者病例20例,根据最新COPD诊断标准和WHO吸烟调查方法标准将其分成3组:A组(非吸烟非COPD组),7例;B组(吸烟非COPD组),7例;C组(吸烟并COPD组),6例,分别收集患者肺组织。同期在该院呼吸内科住院的吸烟并COPD患者10例和健康体检者20例,分为3组:D组(非吸烟非COPD组),10例;E组(吸烟非COPD组),10例(入选时均处于稳定期);F组(吸烟并COPD组),10例,分别收集其外周血5ml。提取肺组织和血标本中基因组DNA,亚硫酸盐修饰后MSP检测COXⅡ甲基化。使用SPSS13.0统计软件进行数据分析,计量资料以(?)±s表示,多组间均数比较采用单因素方差分析(One—Way ANOVA)。计数资料以率表示,组间COXⅡ甲基化阳性率差异用Fisher确切概率法进行比较。P<0.05为差异有统计学意义。 结果:A、B、C三组肺组织标本中COXⅡ甲基化阳性率分别为71.4%(5/7)、71.4%(5/7)和66.7%(4/6),三组间无明显统计学差异(均P>0.50)。D、E、F三组血标本中COXⅡ甲基化阳性率分别为0%(0/10)、50%(5/10)和60%(6/10)。D组与E组或F组比较,COXⅡ甲基化阳性率差异均有统计学差异(均P<0.05),而E组与F组比较,统计学差异不显著(P>0.50)。 结论:COPD患者存在COXⅡ甲基化,该异常甲基化可能与吸烟有关。 第三章CSE诱导HUVEC凋亡中COXⅡ甲基化状态改变及5-杂氮-2'-脱氧胞苷干预的影响 目的:研究CSE诱导HUVEC凋亡的机制,探讨COX在其中的作用,并了解COXⅡ甲基化是否参与其中机制。 方法:第一部分,体外培养HUVEC,给予不同浓度(0%-10%)和不同时间(0h-24h)的CSE处理,TUNEL法检测细胞凋亡,分光光度计检测其COX和caspase-3的活性。第二部分,将HUVEC分为四个处理组:空白组,AZA组,CSE(2.5%)组,AZA+CSE组,分别给予不同的干预,检测各组细胞的凋亡指数和COX活性。荧光RQ-PCR和Western Blot分别检测COXⅡmRNA和COXⅡ蛋白表达。提取各组细胞DNA,MSP法检测各组COXⅡ甲基化状态。用SPSS13.0进行数据分析,计量数据用(?)±s表示,多组间比较采用单因素方差分析(One-WayANOVA)。变量间采用单因素相关分析(Pearson)法。P<0.05为差异有统计学意义。 结果:第一部分:CSE诱导的HUVEC凋亡呈浓度-和时间-依赖。1%CSE组即出现HUVEC凋亡增加[(26.0±2.1)%],2.5%CSE时凋亡指数达到(42.6±2.6)%。此后CSE浓度继续增加,虽然凋亡仍在增加,但细胞坏死也逐渐明显。10%CSE干预24h后HUVEC凋亡达到最高峰(49.5±0.7)%。2.5%CSE干预HUVEC,随着干预时间的延长凋亡逐渐增多。与凋亡相反,随着CSE干预浓度和时间的增加,COX活性下降愈明显,同样呈浓度-和时间-依赖。10%CSE干预24h后,COX活性下降约25.6%。在较低CSE干预浓度(0.5%-2.5%)时caspase-3活性随着CSE浓度增加而增加,2.5%CSE组达到最大值(255.0±24.2%)。而在较高CSE浓度(5%-10%)干预时,caspase-3活性出现回降,10%CSE组降至(68.6±3.7)%,低于空白对照组。经相关分析,HUVEC凋亡与COX活性呈负相关(r=-0.884,P<0.01),而与caspase-3活性无关(r=-0.236,P>0.05)。第二部分:与对照组相比,CSE组[(44.0±3.6)%]和AZA+CSE组[(21.7±2.3)%]HUVEC凋亡增加;而COX活性[分别为(5.94±0.36)×10~(-1)U/mg和(6.83±0.26)×10~(-1)U/mg]、COXⅡmRNA表达[分别为(0.82±0.06)和(1.18±0.08)]和COXⅡ蛋白表达[分别为(0.73±0.05)和(1.10±0.12)]均下降,三组间各指标差异均有统计学意义(均P<0.05)。而AZA组与对照组比较无显著差异。MSP检验发现CSE组和AZA+CSE组出现COXⅡ甲基化阳性表达,而对照组和AZA组甲基化阴性。 结论:(1)CSE诱导HUVEC凋亡呈浓度-和时间-依赖性,该凋亡为非caspase-3-依赖,并由COX介导。(2)CSE可能通过诱导COXⅡ发生甲基化而抑制COXⅡ转录。(3)AZA能一定程度逆转CSE诱导的COXⅡ甲基化,对COX和HUVEC有保护作用。


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