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口腔粘膜下纤维性变发病相关基因的筛选与初步鉴定

胡延佳  
【摘要】: 口腔粘膜下纤维性变(oral submucous fibrosis,OSF)是一种慢性、隐匿性、具有癌变倾向的口腔粘膜病,咀嚼槟榔是主要致病因素,OSF属于口腔癌前状态,癌变率高达7.6%。其发病机制目前尚不清楚。基因芯片技术和生物信息学的发展极大提高了我们对生物学研究和探讨疾病分子机制的能力。其高通量、平行、微型化等显著优点已经受到世界各国科学家高度重视,并已广泛用于肿瘤等多个领域研究。本研究采用Affymetrix U133A 2.0芯片构建OSF粘膜组织的基因表达谱;以正常口腔粘膜组织为对照,采用多种生物信息学方法筛选疾病差异表达基因;经逆转录聚合酶链式反应(reverse transcription polymerasechain reation,RT-PCR)对部分候选基因进行了验证,为进一步探讨OSF发生的分子机制和发现治疗靶基因奠定基础。 第一章口腔粘膜下纤维性变差异基因表达分析 [目的]:建立OSF的基因表达谱并筛选其差异表达基因。 [方法]:收集正常和OSF患者颊粘膜组织各4例,提取其总RNA并制备cDNA,合成生物素标记的cRNA探针,经GeneChip Test3验证了探针质量合格后,与Aflymetrix HG-U133A2.0寡核苷酸基因芯片进行杂交,经过洗涤,扫描后用GeneChip Operating Software(GCOS)软件读取每一张芯片探针组中每一位点的表达值,扣除背景信号,自动分析每一基因位点的表达参数并给出参考值,输出数据,并利用dchip2006软件对原始数据进行归一化处理,构建出OSF组织的基因表达谱。再利用基因芯片显著性分析(signficance analysis of microarray,SAM)中两因素不配对算法计算假阳性率,筛选出其OSF差异表达基因。 [结果]:芯片杂交结果符合质量控制要求;按照q-value<0.05,以fold change>2或<0.5为筛选标准,得到OSF差异表达基因共计865个,其中上调基因716个,下调基因149个。 [结论]:在全基因组范围内建立了OSF的基因表达谱并筛选其差异表达基因,为进一步的发病机制研究和寻找OSF分子标记物奠定了基础。 第二章运用生物信息学方法进行差异表达基因的二次筛选 [目的]:运用生物信息学方法分析口腔粘膜下纤维性变差异表达基因,挖掘其隐含的生物学意义。 [方法]:利用多种生物信息学工具和软件对前期筛选的865个OSF差异表达基因进行聚类分析,GO分析、Pathway分析、染色体定位、遗传关联疾病分析和MILANO分析。 [结果]:聚类分析显示所筛选的基因能很好区分正常组与病例组,其中最显著的基因亚类为免疫相关基因。GO分析显示差异表达基因主要参与免疫反应,细胞粘附、炎症反应、DNA依赖的转录调节等生物过程;大部分基因表达蛋白位于细胞外区域、细胞外基质和细胞质膜、膜或整合于膜上。119个基因为未知功能基因,另外有大量的钙铁锌结合分子,其他基因与受体激活和细胞外基质结构构成等分子功能相关;Pathway分析结果显示差异表达基因主要参与抗原过程和呈递、细胞外基质受体相互作用、局部粘附、细胞粘附分子、细胞因子间相互作用、TGF-β信号通路等通路。染色体定位显示差异表达基因主要定位于1、2、5、6、7、11和12号染色体上(P<0.01);而与这些基因有遗传关联的疾病主要有感染,免疫和心血管疾病等。MILANO分析显示大部分在纤维化疾病和肿瘤中研究广泛的基因在OSF中未曾研究。 [结论]:运用生物信息学工具可快速、平行地分析大量的基因芯片数据,实现对差异基因初步的功能归类,为OSF的发病机制和流行病学研究提供新的思路。 第三章半定量RT-PCR对部分差异表达基因的验证 [目的]:筛选和验证候选基因,并初步探讨其在OSF中的作用。 [方法]:根据多种生物信息学方法和文献复习确定候选基因;抽提11例口腔粘膜下纤维化组织和10例正常口腔粘膜组织的总RNA,通过逆转录聚合酶链式反应检测候选基因在口腔粘膜下纤维性变患者颊粘膜和正常颊粘膜中mRNA的表达。 [结果]:挑选出6个与上皮间质转化(epithelial-mesenchymaltransition,EMT)相关候选基因:sFRP4、THBS1、MMP2、CDH11、ZO-1、CK18。所有的RT-PCR检测表现出与芯片结果一致的变化趋势,统计学处理sFRP4、ZO-1、CK18的P值<0.01,THBS1和MMP2的P值<0.05,CDH11的P值>0.05。 [结论]:基因芯片结果可靠,EMT可能在OSF发病机制中起着重要作用。


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