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辣椒素抗疲劳作用及其机理研究

郭时印  
【摘要】: 第一章前言 疲劳是人脑力或体力到达一定阶段时必然出现的一种正常的生理现象,是机体复杂的生理生化变化过程。随着社会节奏的加快,社会竞争日益激烈,疲劳已成为威胁人类健康的重要因素。因而延缓疲劳的发生和促进疲劳的恢复成为营养卫生学、航天医学、军事医学、运动医学、保健医学、康复医学等学科的研究重点。 目前,消除疲劳的主要措施有休息、睡眠、按摩及某些物理方法等,这些虽然能消除疲劳,但在效果上仍有不如人意的地方。在寻找更安全、更有效的抗疲劳方法中,从天然产物中提取的活性物质由于其副作用少,不含对人体有害的兴奋剂成分而成为近年来抗疲劳研究的热点。 辣椒素(capsaicin)是辣椒中的主要辛辣成分,可特异地作用于辣椒素敏感C类纤维(CSPNs)的辣椒素受体(VR),继而操纵非选择性阳离子通道,引起一些活性物质释放,进而发挥作用。研究表明,辣椒素具有提高运动能力的功能,说明辣椒素可能具有抗疲劳的作用,但目前关于辣椒素抗疲劳的作用机理及其量效研究还不深入和系统,辣椒素对海马神经元的保护作用及相关机制的研究尚未见报道。 第二章辣椒素抗疲劳作用的动物实验研究 目的:观察辣椒素对小鼠的抗疲劳效果。 方法:将168只雄性昆明种小鼠按体重随机分为7组:(1)正常对照组:灌胃等体积蒸馏水。(2)溶媒对照组:灌胃等体积的溶媒(10%乙醇+10%吐温80液+80%的生理盐水)。(3)低剂量辣椒素组:按3mg/kg·wet·d的剂量灌胃辣椒素。(4)中剂量辣椒素组:按6mg/kg·wet·d的剂量灌胃辣椒素。(5)中高剂量辣椒素组:按10mg/kg·wet·d的剂量灌胃辣椒素。(6)高剂量辣椒素组:按15mg/kg·wet·d的剂量灌胃辣椒素。(7)红景天(Rhodiola Rosea)阳性对照组:按干品1g/kg·wet·d的剂量灌胃。所有动物于每日晨起8时定时灌胃1次。 灌胃28d后检测小鼠的体重,并检测小鼠的爬杆时间、负重游泳时间以及小鼠运动后血乳酸水平、肝糖原含量、血尿素氮含量及血乳酸脱氢酶的活力,作为抗疲劳实验的检测指标;以常压耐缺氧时间和急性脑缺血性耐缺氧时间,亚硝酸钠中毒时间作为抗缺氧实验的检测指标。 结果:(1)辣椒素对小鼠体重增长无明显影响;(2)辣椒素可以明显延长小鼠的爬杆时间、负重游泳时间,低剂量处理组(3mg/kg)与正常对照组相比差异无统计学意义;中剂量、中高剂量、高剂量组与正常对照组相比,差异有统计学意义,且以高剂量(15mg/kg)时作用最明显;(3)辣椒素低剂量组(3mg/kg)小鼠常压耐缺氧时间和急性脑缺血性耐缺氧时间与正常对照组差异均无统计学意义(P>0.05);而辣椒素中、中高及高剂量组小鼠耐缺氧时间均显著延长,与正常对照组相比差异有统计学意义(P<0.05),其中以高剂量组(15mg/kg)作用最明显,其常压耐缺氧时间和耐急性脑缺血性缺氧时间分别提高了约64%和107%,且高剂量组与红景天阳性对照组差异无统计学意义。(4)辣椒素灌胃组小鼠运动后肝糖原、肌糖原含量及血乳酸脱氢酶活力均显著高于正常对照组,而运动后的血乳酸水平、血尿素氮水平均显著低于正常对照组,其中均以高剂量组(15mg/kg)作用最明显。(5)辣椒素灌胃组小鼠亚硝酸钠中毒存活时间与正常对照组相比,显著延长,差异有统计学意义(P<0.05)。 结论:辣椒素在6~15mg/kg范围内,可以显著延长小鼠的爬杆和力竭游泳时间,提高其抗缺氧的能力,并可以抑制运动后血乳酸和血尿素氮的生成,维持运动后小鼠肝脏和肌肉组织内糖原的含量,具有明显的抗运动疲劳的作用。 第三章辣椒素抗疲劳作用的生化机制研究 目的:在第二章的研究基础上,选择合适剂量的辣椒素,进一步探讨辣椒素抗疲劳的作用机制。 方法:分别从以下4方面探讨辣椒素抗疲劳的作用机制: (1)抗氧化系统:①检测各组小鼠运动前后肝组织超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)及脂质过氧化产物丙二醛(MDA)含量;②检测血浆中肌细胞损伤的标志性酶肌酸激酶(CK)及肌酸激酶MB亚型(CK-MB)含量。 (2)能量代谢系统:①检测各组小鼠运动前后血糖的水平,肌、肝糖原含量;②检测各组小鼠运动前后血浆游离脂肪酸(FFA)浓度:③检测血浆总蛋白(TP)、白蛋白(Al)、球蛋白(Glob)含量; (3)中枢系统:①各组大鼠进行睡眠剥夺72h后,进行旷场实验,计算各组睡眠剥夺后的旷场实验评分;②将各组大鼠处死后,迅速取大鼠下丘脑、海马组织,检测5-羟色胺(5-HT),去甲肾上腺素,肾上腺素,多巴胺,5-羟基吲哚乙酸(5-HIAA)的含量,并检测血氨含量。 结果: (1)抗氧化系统: ①运动前,各组肝脏SOD、GSH-Px活性和肝脏MDA的水平差异无统计学意义(P>0.05或P>0.01);运动后,不同浓度辣椒素灌胃组肝脏SOD和GSH-Px活性与正常对照组相比,显著升高,而肝脏MDA的水平显著降低,差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01),其中以高剂量组(15mg/kg)作用最明显。 ②运动前辣椒素灌胃组与正常对照组相比,血浆CK、CK-MB含量差异无统计学意义(P>0.05)。长时间运动后,不同浓度辣椒素处理组的血浆CK及CK-MB的含量显著降低,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01),其中以高剂量辣椒素处理组(15mg/kg)作用最明显。 (2)能量代谢系统: ①静止状态下,各组小鼠的血糖水平差异无统计学意义(P>0.05):运动后,各组小鼠的血糖均有所降低,但运动后不同浓度辣椒素处理组的血糖水平均较正常运动对照组的血糖水平显著增高,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01);运动后不同浓度辣椒素处理组肝糖原和肌糖原含量均较正常运动对照组显著升高,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。 ②运动后,分别检测各组血浆FFA的含量,结果表明红景天能显著降低运动后血FFA;而不同浓度的辣椒素处理组的血浆FFA的含量与空白运动组相比均显著增高,且与空白运动组相比差异有统计学意义(P<0.01)。 ③各组小鼠运动前后的血浆TP、AL和Glob水平差异均无统计学意义。 (3)中枢系统: ①睡眠剥夺72h后,与空白睡眠组相比,空白睡眠剥夺组的OFT评分显著降低;咖啡因阳性对照组及不同浓度的辣椒素处理组与空白睡眠剥夺组相比,OFT得分显著升高,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01),且以辣椒素高剂量组(15mg/kg)作用最明显,差异有统计学意义(74±9 vs 49±7,P<0.01)。 ②空白睡眠剥夺组与空白睡眠组相比下丘脑和海马的5-HT、5-HIAA水平显著升高,差异有统计学意义(14.38±1.37vs 12.76±1.25,P<0.01):咖啡因阳性对照组及不同浓度的辣椒素处理组与空白睡眠剥夺组相比下丘脑和海马的5-HT、5-HIAA水平显著降低,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01),且以辣椒素高剂量组(15mg/kg)作用最明显(11.19±1.26vs 14.38±1.37,P<0.01),与咖啡因阳性对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。 ③与空白正常睡眠组相比,空白睡眠剥夺组下丘脑组织的肾上腺素、去甲肾上腺素及多巴胺的含量均显著降低,差异有统计学意义(P<0.01);与空白睡眠剥夺组相比,咖啡因阳性对照组,不同浓度的辣椒素处理组下丘脑的肾上腺素、去甲肾上腺素及多巴胺的含量均显著升高,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01),且以高剂量(15mg/kg)作用最明显,与咖啡因阳性对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。 ④睡眠剥夺前,各组大鼠的血NH_3水平差异无统计学意义。空白睡眠剥夺组与空白睡眠组相比血NH_3水平显著升高,差异有统计学意义(318.6±34.8 vs 166.7±20.8,P<0.01);咖啡因阳性对照组及不同浓度的辣椒素处理组与空白睡眠剥夺组相比血NH_3水平显著降低,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01),且辣椒素的作用为高剂量组(15mg/kg)作用最明显,(158.5±27.9vs 318.6±34.8,P<0.01),与咖啡因阳性对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。 结论:辣椒素具有显著的抗疲劳作用,其机制可能为①增强小鼠抗氧化酶的活性,清除氧自由基,减少长时间运动引起的心肌的损伤;②增强脂肪的代谢,从而减少血糖的消耗,维持运动后的血糖水平;③减少中枢的5-羟色胺和血NH_3的生成,并可升高肾上腺素、去甲肾上腺素及多巴胺的含量,从而使多巴胺/5-羟色胺的比值维持在较高水平,调节中枢活动。 第四章辣椒素对缺氧/复氧诱导的海马神经元凋亡的影响 目的:辣椒素对H/R诱导神经元凋亡的保护作用并进一步探讨了该作用可能涉及的细胞分子机制。 方法:选用妊娠18d的SD大鼠的胎鼠,分离和培养海马神经元组织,微管结合蛋白2(MAP2)抗体免疫荧光鉴定;取培养8-10 d生长良好的海马神经元用于实验。3h缺氧(1%O_2)和随后24h复氧诱导海马神经元细胞损伤。原位TUNEL法检测细胞凋亡程度;比色法试剂盒检测caspase-3活性;Western blot检测Akt蛋白磷酸化;荧光法检测细胞内活性氧(ROS)水平。 结果: ①海马神经元的培养及鉴定:取培养8 d的细胞,进行MAP2抗体免疫荧光鉴定,结果显示神经元纯度为94.5±2.1%。 ②TUNEL染色结果显示,H/R能诱导海马神经元凋亡,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。同时,H/R也能显著增加神经元caspase-3的活性。而处理辣椒素(3-30μM)和caspase-3特异性抑制剂DEVD-CHO(100M)能显著抑制H/R诱导的海马神经元凋亡和caspase-3活性的增加。 ③H/R能显著增加细胞内ROS生成,而预先给予细胞内抗氧化剂PDTC(50M)或辣椒素(3-30M)能显著抑制H/R诱导的ROS生成增加。预先给予PDTC也能显著抑制H/R诱导的caspase-3活性增加。 ④辣椒素能显著诱导Akt磷酸化;PI3K抑制剂LY294002(10M)能完全取消辣椒素诱导的Akt磷酸化。而且,LY294002也能显著抑制辣椒素降低细胞内ROS生成和抗凋亡作用。 ⑤VR1受体阻断剂辣椒辣素(1M)能完全取消辣椒素诱导的Akt磷酸化作用,同时也能阻断辣椒素抗凋亡作用。预处理[Ca~(2+)]_i的鳌合剂BAPTA/AM(5M)也能取消辣椒素诱导的Akt磷酸化和抗凋亡作用。 结论:辣椒素能抑制H/R诱导的海马神经元凋亡,其机制与激活VR1—Ca~(2+)通路,经PI3K/Akt信号转导途径抑制氧化应激和caspase-3激活有关。辣椒素的神经元保护作用可能是其抗脑I/R损伤的细胞分子机制之一。


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