鞘内注射不同浓度罗哌卡因在不同时间点对大鼠脊髓神经毒性的影响及其机制的研究

【摘要】： 目的 观察鞘内注射不同浓度的罗哌卡因及其在不同时间点对大鼠脊髓、神经根超微结构的影响,并探讨P38磷酸化及线粒体介导的凋亡途径是否参与罗哌卡因的脊髓神经毒性,为临床上安全使用罗哌卡因提供理论依据。 方法 1改良Yaksh法鞘内置管成功的雄性SD大鼠30只,体重为250-320g,随机分为生理盐水组(N1组,n=6)、罗哌卡因组(R1组),而R1组大鼠鞘内分别注入0.25%、0.5%、0.75%、1.0%罗哌卡因0.12μl/g,间隔1.5h给药1次,持续给药48h,分别记为“R0.25组、R0.5组、R0.75组、R1.0组”(n=6),N1组则给予等量的生理盐水,给药方式与R1组一样;另取改良Yaksh法暴露寰枕膜后不置管的6只雄性SD大鼠,体重为250-320g,记为假手术组(S1组,n=6),S1组不给药。通过分别检测给药前和最后1次给药1.5h后各组大鼠后爪机械刺激回缩阈值(即机械痛阈)、热刺激回缩阈值(即热痛阈)的最大效应百分比以及最后1次给药后运动功能评分来观察其行为学的变化;在完成行为学检测后处死大鼠,取脊髓腰膨大及相应节段神经根行光镜和电镜检查,并进行病理学评分;TUNEL法检测脊髓组织细胞凋亡;PT-PCR法检测脊髓组织caspase-3,9,8 mRNA的表达;Western Blot法检测脊髓组织磷酸化p38、活化caspase-3蛋白表达及胞质内细胞色素C释放情况。 2改良Yaksh法鞘内置管成功的雄性SD大鼠30只,体重为250-320g,随机分为对照组(N2组,n=6)、罗哌卡因组(R2组)。R2组鞘内注射0.75%罗哌卡因0.12μl/g,间隔1.5h给药1次,分别持续给药12h、24h、36h、48h,记为“R12组、R24组、R36组、R48组”(n=6)。通过监测R2组大鼠给药前和最后1次给药1.5h后机械痛阈、热痛阈的最大效应百分比及最后1次给药后运动功能评分来观察其行为学的变化,并在完成行为学检测后处死大鼠;N2组则不给药,监测N2组给药前及R2组大鼠第1次给药时的机械痛阈、热痛阈的最大效应百分比,并在完成行为学检测后处死;各组大鼠处死后取脊髓腰膨大组织及相应节段神经根与第一部分进行相同的检测。 3将PC12细胞分为三组:对照组(N3):不予任何特殊处理,常规培养48h;罗哌卡因组(R组):15mmol/L罗哌卡因处理48h;罗哌卡因+p38抑制剂SB203580组(R+S组):15mmol/L罗哌卡因+10μmol/L p38特异性抑制剂SB203580处理48h。检测干预后各组细胞计数以及MTT法测定细胞存活率的变化,Western Blot法检测磷酸化p38、活化caspase-3蛋白表达及胞质内细胞色素C释放的情况。 结果 1各组大鼠热痛阈和机械痛阈的最大效应百分比无统计学差异(P＞0.05),R1各组大鼠每次注药后30s内出现双后肢的麻痹,R0.25组双后肢恢复最快(P＜0.05),R1.0组双后肢恢复最慢(P＜0.05),R0.5组和R0.75组,介于两者其中;电镜结果显示:R0.5组线粒体结构模糊,部分粗面内质网轻度扩张,部分有髓神经纤维髓鞘板层结构疏松;R0.75组线粒体结构肿胀,粗面内质网轻中度扩张,少数神经元的胞核出现固缩,有髓神经纤维的板层结构疏松;R1.0组线粒体呈空泡样变性;粗面内质网极度扩张,神经元细胞核皱缩、甚至裂解为碎块,产生凋亡小体,髓鞘增厚,甚至崩解消失;R0.75与R1.0组的组织病理学损伤评分、TUNEL染色阳性细胞较N1组高,(P＜0.05);R0.5、R0.75、R1.0组的caspase-3、9的mRNA表达以及磷酸化p38、活化caspase-3的蛋白表达、胞质中细胞色素C的释放较N1组高(P＜0.05); 2与N2组比较,R12、R24、R36、R48组大鼠给药前后热痛阈和机械痛阈的最大效应百分比和运动阻滞评分无统计学差异(P＞0.05);电镜结果显示:R12与R24组线粒体轻度水肿,少数内质网轻中度扩张,髓鞘的板层结构疏松,R36组和R48组线粒体、内质网、髓鞘板层结构的肿胀程度更为严重,神经元胞核出现一定程度的固缩,部分染色质出现浓缩状态;R36组和R48组大鼠的组织病理学损伤评分、TUNEL染色阳性细胞数较N2组高(P＜0.05);R24、R36、R48组大鼠脊髓组织中caspase-3、9 mRNA的表达水平较N2组高(P＜0.05);R12、R24、R36、R48组大鼠脊髓组织中磷酸化p38蛋白的表达较N2组高,以R12组磷酸化p38水平最高(P＜0.05);而R24、R36、R48组大鼠脊髓组织中活化caspase-3的蛋白水平、胞质中细胞色素C的释放水平较N2组高,以R48组活化caspase-3蛋白和胞质中细胞色素C水平最高(P＜0.05); 3与N3组相比,R组、R+S组的细胞计数和细胞存活率均减少(P＜0.05),而磷酸化P38、活化caspase-3蛋白表达以及胞质中细胞色素C的释放均增高(P＜0.05);与R组相比,R+S组的细胞计数和细胞存活率均增高(P＜0.05),磷酸化p38、活化caspase-3蛋白表达及胞质中细胞色素C的释放均减少(P＜0.05)。 结论 1鞘内注射0.5%,0.75%,1.0%的罗哌卡因48小时的大鼠脊髓和神经根产生浓度依赖性的超微结构改变,其中0.75%,1.0%罗哌卡因引起的组织病理学改变较对照组重,同时产生的凋亡细胞较对照组多。 2鞘内注射0.75%的罗哌卡因24h,36h,48h可使大鼠脊髓和神经根产生时间依赖性的超微结构改变,超过36h可使脊髓组织病理学改变较对照组重,同时产生的凋亡细胞较对照组多。 3 P38的磷酸化以及线粒体介导的细胞凋亡参与了罗哌卡因神经毒性的机制,同时P38的磷酸化先于活化caspase-3蛋白和胞质中细胞色素C水平的升高。 4 P38特异性抑制剂SB203580的应用可通过降低活化caspase-3蛋白和胞质中细胞色素C的水平来减少罗哌卡因对PC12细胞的毒性作用。