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RNA干扰沉默TREM-1对脆弱类杆菌脓毒症炎症反应的抑制作用及其机制研究

宋达疆  
【摘要】: 目的构建髓系细胞触发受体1(TREM-1)基因重组慢病毒RNA(vshRNA)载体,通过抑制TREM-1的表达,进一步探讨TREM-1对脆弱杆菌脓毒症小鼠促炎因子表达及生存率的影响,以及TREM-1对NF-κB通路的相互影响。 方法(1)以脆弱类杆菌对小鼠行腹腔注射造成脆弱杆菌脓毒症小鼠模型。收集肝组织提取总RNA或总蛋白,半定量RT-PCR法检测TREM-1 mRNA的表达,Western blot法检测TREM-1蛋白的表达,并用ELISA法检测血浆中TNF-α、IL-1β与IL-6的含量。 (2)根据小鼠TREM-1的mRNA序列选择4个靶序列并设计合成4对双链DNA oligo,同时合成1对阴性对照双链DNA oligo;将以上5对双链DNA oligo退火后连入pGCSIL-GFP载体,PCR和测序鉴定后,将以上质粒分别和包装质粒混合物共转染293T细胞,包装产生病毒颗粒。各组病毒载体转染Raw264.7细胞后,实时定量PCR、ELISA观察干扰TREM-1后脆弱杆菌内毒素引发的Raw264.7细胞内毒素血症模型中TREM-1的表达变化。 (3)建立脆弱杆菌小鼠脓毒症模型并运用TREM-1 vshRNA进行整体转染,观察TREM-1 vshRNA对TREM-1的抑制情况,并检测相关炎症因子在组织及血浆中的表达。将15只小鼠随机按数字表法分为5组(每组3只),即正常对照组和阳性对照组、TREM-1干扰组、TREM-1半量干扰组、绿色荧光蛋白(GFP)干扰组。按组分别经尾静脉注射等渗盐水、TREM-1 vshRNA 2×10~8TU、TREM-1 vshRNA 1×10~8TU、GFP vshRNA;1 h后,后4组小鼠同前制成脓毒症模型,正常对照组腹腔注射等体积等渗盐水。12 h后处死5组小鼠(每组3只),检测肝组织及血浆TNF-α、IL-1β和IL-6含量;取肝脾组织标本检测TREM-1mRNA及其蛋白的表达水平,以及肝内IκBα、pDAP12和核内NF-κBp65的蛋白表达情况的变化。。 (4)对脆弱杆菌脓毒症小鼠尾静脉注射TREM-1 vshRNA后,观察小鼠的存活率。将清洁级BALB/c雄性小鼠225只按随机数字表法分为3组。第1组100只小鼠又随机分为阳性对照组、TREM-1干扰组、TREM-1半量干扰组、绿色荧光蛋白(GFP)干扰组,每组25只。第2组100只小鼠随机分为4组(每组25只),分别于腹腔注射脆弱杆菌后1、2、4、6 h尾静脉注射TREM-1vshRNA 2×10~8TU。第3组25只小鼠行尾静脉注射等渗盐水作为对照组。计算各组小鼠腹腔注射脆弱杆菌后72 h存活率。 结果(1)在脆弱类杆菌刺激下,小鼠肝细胞中TREM-1表达水平上调呈时间依赖性,于12h达高峰;而脆弱类杆菌对TREM-1的诱导作用同时又呈剂量依赖性,同时伴有TNF-α、IL-1β及IL-6的表达增高,并分别与TREM-1蛋白表达水平呈正相关(rs=0.82,0.85,0.83及0.88,P<0.01)。经实验确定,对小鼠行腹腔注射1.5×10~9 CFU/mL脆弱拟杆菌0.5 mL并刺激12 h后能够形成典型的脓毒症动物模型。 (2)成功构建TREM-1基因重组慢病毒RNA(vshRNA)载体。各质粒与包装质粒共转染293T细胞后产生了高滴度的慢病毒颗粒;各组慢病毒感染Raw264.7细胞后都可以显著抑制TREM-1的表达,以第一组效果最明显。在脆弱杆菌内毒素引发的体外细胞内毒素血症模型中TREM-1表达明显增高,实时定量PCR表明TREM-1慢病毒干扰载体能显著抑制模型中TREM-1的表达。 (3)TREM-1干扰组、TREM-1半量干扰组与阳性对照组的小鼠进行比较,血浆及肝组织TNF-α、IL-1β、IL-6表达均下降(P<0.05),而GFP干扰组中TNF-α、IL-1β、IL-6表达与阳性对照组无明显差异(P>0.05)。转染TREM-1 vshRNA后肝脾内TREM-1 mRNA及蛋白表达均有明显下调(P<0.01)。TREM-1 vshRNA转染能明显下调脆弱类杆菌作用下脆弱杆菌脓毒症小鼠肝细胞中DAP12、核内NF-κB p65蛋白的表达并上调IκBα蛋白的表达水平,而GFP干扰组无类似效果。 (4)脓毒症模型中,GFP干扰组和阳性对照组中小鼠在腹腔注射脆弱杆菌后72 h生存率均仅有16%。TREM-1干扰组及其半量干扰组生存率分别为76%和44%,明显高于GFP干扰组和阳性对照组(P<0.05或P<0.01)。另外两组脓毒症小鼠模型中,对照组及腹腔注射脆弱杆菌后1、2、4、6 h组再行尾静脉注射的72 h存活率分别为16%、72%、56%、40%、16%,其中1、2、4 h组明显高于对照组(P<0.05或P<0.01)。 结论小鼠肝组织中TREM-1的表达水平在脆弱类杆菌的诱导下呈时间-剂量依赖性增高。成功构建了小鼠TREM-1基因RNAi慢病毒载体。证实所构建的慢病毒载体能够抑制脆弱类杆菌LPS所诱导的TREM-1的表达。运用尾静脉注射小鼠TREM-1基因RNAi慢病毒载体进行TREM-1干扰可有效降低脆弱杆菌脓毒症小鼠肝脾组织TREM-1表达水平,下调脆弱类杆菌诱导的促炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表达,提高小鼠存活率,同时下调脆弱类杆菌作用下脓毒症小鼠肝细胞中DAP12、核内NF-κB p65的蛋白表达并上调IκBα蛋白的表达水平。而转染可能是通过下调DAP12的表达,稳定IκBα/NF-κB复合物,抑制TNF-α、IL-1β及IL-6的表达,而对脆弱类杆菌炎症反应产生抑制作用。 第一章TREM-1在脆弱类杆菌小鼠脓毒症模型中的表达 目的探讨在脆弱类杆菌所诱导的小鼠脓毒症炎症反应中肝细胞TREM-1的表达情况及其与促炎症因子分泌的关系。 方法厌氧分离培养脆弱类杆菌临床株后,以脆弱类杆菌对小鼠行腹腔注射造成细菌性腹膜炎。收集肝组织提取总RNA或总蛋白,半定量RT-PCR法检测TREM-1 mRNA的表达,Western blot法检测TREM-1蛋白的表达,并用ELISA法检测血浆中TNF-α、IL-1β与IL-6的含量。 结果在脆弱类杆菌刺激下,小鼠肝细胞中TREM-1表达水平明显上调,并呈时间依赖性,于12h达高峰;而不同浓度的脆弱类杆菌对TREM-1的诱导作用呈剂量依赖性,以2.5×10~9 CFU/mL浓度的诱导效应最明显;同时伴有TNF-α、IL-1β及IL-6的大量分泌,并分别与TREM-1蛋白表达水平呈正相关(rs=0.82,0.85,0.83及0.88,P<0.01)。 结论TREM-1表达水平在脆弱类杆菌的诱导下呈时间-剂量依赖性增高,TREM-1与促炎症因子分泌可能具有相关性。构建的脆弱类杆菌小鼠脓毒症模型为后续研究提供了实验平台。 第二章髓系触发受体-1基因RNAi慢病毒载体的构建及功能初步检测 目的构建TREM-1基因RNAi慢病毒载体,探讨TREM-1在脆弱类杆菌所致炎症反应中的作用。 方法根据小鼠TREM-1的mRNA序列选择4个靶序列并设计合成4对双链DNA oligo,其两端含酶切位点粘端,同时合成1对阴性对照双链DNA oligo;将以上5对双链DNA oligo退火后连入pGCSIL-GFP载体,PCR和测序鉴定后,将以上质粒分别和包装质粒混合物共转染293T细胞,包装产生病毒颗粒。各组病毒载体转染Raw264.7细胞后,运用Real-Time PCR和ELISA检测TREM-1 mRNA和蛋白表达水平。实时定量PCR、ELISA观察干扰TREM-1后脆弱杆菌内毒素引发的Raw264.7细胞内毒素血症模型中TREM-1的表达变化。 结果PCR和测序证实目的双链DNA oligo片段已被准确克隆到pGCSIL-GFP载体;各质粒与包装质粒共转染293T细胞后产生了高滴度的慢病毒颗粒;各组慢病毒感染Raw264.7细胞后都可以显著抑制TREM-1的表达,以第一组效果最明显。在脆弱杆菌内毒素引发的体外细胞内毒素血症模型中TREM-1表达明显增高,实时定量PCR表明慢病毒干扰载体能显著抑制模型中TREM-1的表达。 结论成功构建了小鼠TREM-1基因RNAi慢病毒载体。证实所构建的慢病毒载体能够抑制脆弱类杆菌LPS所诱导的TREM-1的表达。 第三章髓系细胞触发受体1慢病毒载体对脆弱拟杆菌脓毒症小鼠促炎因子表达的影响 目的了解髓系细胞触发受体1(TREM-1)基因重组慢病毒短发夹RNA(vshRNA)载体对脆弱拟杆菌脓毒症小鼠促炎因子表达及生存率的影响。 方法(1)构建TREM-1 vshRNA载体,经实验确定脓毒症小鼠模型制作条件:腹腔注射2.5×10~9 CFU/mL脆弱拟杆菌0.5 mL,刺激12 h。(2)15只小鼠按随机数字表法分为正常对照组和脓毒症模型组、TREM-1干扰组、TREM-1半量干扰组、绿色荧光蛋白(GFP)干扰组,每组3只。分别经尾静脉注射等渗盐水、TREM-1 vshRNA 2×10~8TU、TREM-1 vshRNA 1×10~8TU、GFP vshRNA;1 h后,后4组小鼠同前制成脓毒症模型,正常对照组注射等体积等渗盐水。12 h后处死5组小鼠(每组3只),取血检测血浆TNF-α、IL-1β和IL-6含量;取肝组织标本检测TREM-1 mRNA及其蛋白的表达水平。(3)将清洁级BALB/c雄性小鼠225只按随机数字表法分为3组。第1组100只小鼠随机分为脓毒症模型组、TREM-1干扰组、TREM-1半量干扰组、绿色荧光蛋白(GFP)干扰组,每组25只。第2组100只小鼠随机分为5组(每组25只),分别于腹腔注射后1、2、4、6 h尾静脉注射TREM-1 vshRNA 2×10~8TU。另25只尾静脉注射等渗盐水为对照组。计算腹腔注射后72h各组小鼠存活率。 结果(1)与脓毒症模型组比较,TREM-1干扰组、TREM-1半量干扰组小鼠血浆TNF-α、IL-1β、IL-6含量均下降(P<0.05),以TREM-1干扰组下降最明显。GFP干扰组中各促炎因子含量与脓毒症模型组接近(P>0.05)。(2)与对照组比较,TREM-1干扰组及其半量干扰组小鼠肝组织TREM-1mRNA表达均明显下调(P<0.01),以TREM-1干扰组尤为明显(P<0.05)。TREM-1蛋白的表达与此一致。(3)脓毒症模型组、GFP干扰组小鼠腹腔注射后72 h后生存率均仅有16%。TREM-1干扰组及其半量干扰组生存率明显偏高,分别为76%和44%(P<0.05或P<0.01)。(4)对照组及腹腔注射后1、2、4、6 h组脓毒症小鼠模型其尾静脉注射后72 h存活率分别为16%、72%、56%、40%、16%,其中1、2、4 h组明显高于对照组(P<0.05或P<0.01)。 结论运用TREM-1 vshRNA干扰技术,可以有效降低脆弱拟杆菌脓毒症小鼠肝组织TREM-1表达水平,抑制炎性因子TNF-α、IL-1β及IL-6的表达,提高小鼠存活率。 第四章RNA干扰沉默TREM-1对脆弱类杆菌脓毒血症抑制作用的机制 目的探讨小鼠TREM-1基因重组慢病毒干扰载体(Lentivector,LV)TREM-1vshRNA对脆弱杆菌脓毒血症小鼠脾脏中TREM-1及肝脏中促炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6表达以及NF-κB通路的影响。 方法将清洁级BALB/c雄性小鼠100只分成4组,即正常对照组(C组),脆弱类杆菌脓毒症模型生理盐水组(S组),TREM-1vshRNA干扰实验组(T组)和GFPvshRNA干扰实验组(G组)。观察各组中小鼠脾内TREM-1及肝内TNF-α、IL-1β、1L-6、IκBα、pDAP12和核内NF-κB p65的蛋白表达情况的变化。 结果与正常对照组相比较,S组和G组小鼠脾内TREM-1及肝内TNF-α、IL-1β、1L-6表达都明显上调,而与S组和G组相比较,T组脾内TREM-1 mRNA及蛋白表达均有明显下调(P<0.01);肝细胞中TNF-α,IL-1β与IL-6的表达也明显降低(P<0.01)。与脆弱类杆菌脓毒症模型生理盐水组相比较,TREM-1 vshRNA转染能明显下调脆弱类杆菌作用下肝细胞中DAP12、核内NF-κB p65蛋白的表达并上调IκBα蛋白的表达水平。 结论小鼠TREM-1vshRNA可选择性抑制TREM-1表达,下调脆弱类杆菌诱导的促炎症因子的分泌,而转染可能是通过下调pDAP12的表达,稳定IκBα/NF-κB复合物,抑制TNF-α、IL-1β及IL-6的表达,而对脆弱类杆菌炎症反应产生抑制作用。


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