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日本血吸虫病免疫传感技术检测方法的研究

车宏莉  
【摘要】: 研究背景: 日本血吸虫病是一种危害严重的人兽共患寄生虫病,主要流行在发展中国家,目前,在我国湖区5省和山区2省仍在流行。血吸虫病的快速诊断的研究对于传染源的监测,疫情的控制将起到积极作用。一般认为,血吸虫病现场应用的理想诊断、筛查方法应具备以下特点:特异、敏感、价廉、简便、稳定和快速。但是,我国血吸虫病的现场查病方法仍然以粪检(kato-katz法)和IHA、ELISA等方法为主。由于粪检费时费力,阳性检出率较低,尤其在轻度流行区漏检率高,已不适宜于大面积疫区人群的筛查。常规ELISA方法操作复杂、现场难以推广应用。因此,研究快速、灵敏、准确、成本较低、简便易行的新型诊断技术和方法,已成为当前血吸虫病诊断迫切需要解决的问题。 研究目的: 将免疫方法和传感技术相结合,研究免疫传感技术检测日本血吸虫病的不同测试体系,为研制灵敏、简便、自动、定量分析的免疫传感检测装置奠定基础。 研究方法: (1)利用巯基混合自组装单层膜(mixed SAMs)技术,以金硫键将巯基丙酸(MPA)和巯基乙醇(ME)混合物自组装在石英晶振表面,通过偶联试剂将日本血吸虫成熟虫卵可溶性抗原(SEA)交联到晶振上,从而开发了一种新的压电免疫传感器,用于血清中日本血吸虫抗体(SjAb)的直接检测。 (2)采用自组装膜技术在石英晶振表面制备巯基丙酸(MPA)和巯基乙醇(ME)混合基底膜,通过偶联剂活化膜上羧基用于日本血吸虫抗原(SjAg)的高效共价固定。通过夹心式免疫反应引入辣根过氧化酶(HRP)标记二抗,利用HRP催化H_2O_2氧化底物4-氯-1-萘酚,在晶振表面形成不溶性沉积物,使免疫检测信号得以显著放大,提高检测的灵敏度。 (3)采用印刷电极开发便携式、一次性的电化学生物传感器。将碳浆和银浆印刷在PET板,做成二电极的试条,工作电极为碳电极,在工作电极上以不同的方法固定SEA,参比电极为银和氯化银电极,通过循环伏安法(CV法)和示差脉冲伏安法(DPV法)来检测抗体的效价,比较几种不同固定方法的检测效果。 (4)采用磁性颗粒为载体固定日本血吸虫抗原的方法,将日本血吸虫抗原通过共价吸附到核壳结构的磁性颗粒表面,与待测抗体反应后,再与酶标二抗夹心反应,最后以3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)为底物,通过测定酶催化下荧光强度的变化来检测抗体的浓度。 (5)利用双抗原夹心法,采用日本血吸虫可溶性虫卵抗原(SEA)包被硝酸纤维素膜(NC膜)作为捕获剂,日本血吸虫抗体(SjAb)包被NC膜作对照线,以胶体碳标记SEA作为显色剂,建立快速检测血清中血吸虫抗体的胶体碳试条法,并用灰度传感技术检测测试带灰度来完成半定量分析。 研究结果: (1)与传统采用单一自组装单层膜固定化方法相比,发现基于混合自组装单层膜固化SjAg具有更高的免疫反应活性。在优化的实验条件下,该传感器检测血清稀释范围为1:1 500-1:60,比较了不同SiAb浓度的IRS实际样本,与经典ELISA法相比,相关系数达0.960。 (2)开发了一种基于酶生物催化沉积信号放大的日本血吸虫压电免疫传感器。酶催化底物反应生成不溶物沉积显著放大免疫检测信号,提高了方法的检测灵敏度,传感器检测血清稀释范围为1:10000-1:200。 (3)探索了四种不同的血吸虫抗原固定方法,并研制了四种血吸虫印刷电极免疫传感器:戊二醛交联(GA)传感器、壳聚糖-戊二醛(Chit-GA)交联法传感器、溶胶-凝胶法(Sol-gel)传感器、碳纳米管修饰的溶胶-凝胶法(Sol-gel)传感器。采用阳性兔血清测试戊二醛交联(GA)传感器的检测血清稀释范围为:1:1 000-1:400;壳聚糖-戊二醛(Chit-GA)交联法传感器的检测范围为:1:1 000-1:500;溶胶-凝胶法(Sol-gel)传感器的检测范围为:1:1 000-1:500;碳纳米管修饰的溶胶-凝胶法(Sol-gel)传感器检测范围为:1:2 000-1:100。 (4)首次采用荧光免疫传感分析方法,检测了兔血清中日本血吸虫抗体的浓度,抗体稀释度在1:2×10~5-1:10~4范围内荧光强度响应呈良好的线性关系。 (5)建立了一种快速检测血清中日本血吸虫抗体的胶体碳试纸条免疫诊断方法,引入灰度传感以得出检测带(T带)的灰度,而T带灰度与血清效价具有较好曲线关系,因而可以根据曲线对待测血清作出半定量分析。检测137份血清,与间接血凝法(indirecthaemagglutination assay,IHA)检测结果一致性为98.54%。以IHA试剂盒为参照,该方法的检测敏感性为98.99%,特异性为97.37%。 结论: (1)基于巯基混合自组装单层膜的压电免疫传感器,检测方法灵敏、简便,在实际样品的检测中,取得了满意结果。且检测能力与经典ELISA法相接近,经进一步优化可望用于日本血吸虫病的诊断。 (2)基于巯基化合物混合自组装膜的免疫材料固定化程序可实现SjAg在压电晶振表面的高效固定化,引入的酶催化底物反应生成不溶物步骤可显著放大免疫检测信号,从而提高了检测灵敏度(SjAb浓度稀释比达1:10 000),与常规免疫测定方法相比,该压电免疫传感技术具有灵敏度较高、线性范围较宽、成本低廉等优点,可望用于日本血吸虫病的检测分析。 (3)基于不同的血吸虫抗原固定方法,研制了四种血吸虫印刷电极免疫传感器。四种方法比较,碳纳米管修饰的溶胶-凝胶法(Sol-gel)传感器灵敏度高,线性范围宽,生物材料抗原的使用量少,成本低,为发展成一次性电极快速测试条奠定了基础。 (4)建立了一种荧光免疫传感分析方法并用于日本血吸虫抗体的检测,方法简单实用且具有良好的选择性和重现性,为光学传感检测的研究探索了新的途径。 (5)首次将灰度传感技术应用于日本血吸虫病的诊断,结合胶体碳试纸条,建立一种可实现日本血吸虫抗体半定量检测的方法,该法操作简便,快速,具有较高的敏感性和特异性,适合作血吸虫病的现场诊断,也为免疫传感技术的应用开辟了新的方向。 (6)表1为本文中研究的几种免疫传感器性能比较,免疫荧光检测方法和酶催化沉积放大的压电免疫传感器的灵敏度高,但存在测试时间相对较长,操作复杂的弊端;混合自组装单层膜压电免疫传感器操作简单,检测的灵敏度可以满足血吸虫检测的需要,但存在传感器和测试仪器成本较高,仪器抗干扰性差的问题;基于印刷电极的碳纳米管修饰的溶胶-凝胶传感器检测时间短,仪器和传感器成本低,检测的灵敏度可以满足血吸虫病检测的需要,但目前传感器的重现性与实际应用还存在一定差距;纳米碳颗粒标记的层析免疫试条使用方便,测试时间短,检测的灵敏度可以满足血吸虫筛查的需要,具有一定的实用性,但目前的研究成果尚限于半定量的检测。


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