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耐高温α-淀粉酶菌株的筛选、发酵条件优化及酶基因的克隆

陈晨  
【摘要】: 耐高温α-淀粉酶是目前最重要的工业酶制剂之一,约占酶制剂市场25%的比例。耐高温α-淀粉酶能在较高温度下能够有效快速的分解淀粉,被广泛应用于纺织退浆、发酵、制糖等高温条件下生产工业。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是国内生产耐高温α-淀粉酶的代表菌株之一。 为了获得纺织工业中所需求的耐高温α-淀粉酶,从枯草堆、农田积肥、下水道等处土样中分离得到一株能向胞外分泌耐高温α-淀粉酶的菌株并对其所产酶的酶学性质进行了研究。通过生理生化及分子生物学鉴定,鉴定该菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),并初步命名为Bacillus subtilis C1。Bacillus subtilis C1在基础培养基中(pH 7,温度45℃)培养24h左右达到生长稳定期,在68h时酶活达到最高,为185.6 u·mL~(-1)。对该菌株分泌的耐高温α-淀粉酶的性质研究表明,此α-淀粉酶最适作用pH值为6,最适温度为70℃。酶的耐热性能较好,在70℃下处理1h,仍具有81%的酶活,适合纺织品高温退浆的需要。 为了获得较高的酶活和产量,在实验中,利用Minitab软件中Plackett-Burman设计和响应面分析法,对耐高温α-淀粉酶产生菌Bacillus subtilis C1的发酵培养条件进行了优化。在单次单因子法得出的适宜条件基础之上,综合考虑了所有影响酶活的因素,并对培养条件进行了统计分析,得到了Bacillus subtilis C1产耐高温α-淀粉酶的最佳培养条件。结果表明:优化培养基的组成(200 mL)为麸皮2.16g,棉粕粉1.98g,酵母粉0.40g,NaCl 1.00g,CaCl_2 0.40g,淀粉0.10g。该营养条件下的酶活为2329 u·mL~(-1),约是培养基优化前酶活的12.6倍,酶活有了显著的提高。 根据Gene Bank中已知的α-淀粉酶基因保守序列设计出特异性引物,通过PCR方法从Bacillus subtilis C1基因组DNA中扩增出了预期的1.5kb左右的特异性产物。该片段与已报道的解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的α-淀粉酶编码基因分别有100%和99%的同源性。最大阅读框为1545bp,信号肽序列93bp。重新设计引物,获得去除信号肽的α-淀粉酶编码基因,并将其与pPICZαA载体连接后,电击转化Top 10 F'菌株的感受态细胞,经质粒抽提、酶切鉴定,确认该目的产物已得到成功克隆。该基因的克隆,为构建α-淀粉酶的工程菌奠定了基础。


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