收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

DDAH1和ALDH2基因多态性与高血压及冠心病易感性的关联关系及机制研究

郭亦杰  
【摘要】: 研究背景 原发性高血压或高血压病由于其高发病率和高死亡率,是目前影响人类健康的主要常见疾病之一。大量的研究业已证实,高血压病是由环境与遗传因素共同作用所致的多基因疾病。 血管内皮在维持心血管系统的稳态中发挥极其重要的作用,内皮功能受损是包括高血压病在内的多种心血管疾病的早期表现和共同的病理生理特征。NO是维持血管内皮功能最重要的一种介质之一,由L-精氨酸在一氧化氮合酶(NOS)的催化作用下生成,具有血管舒张作用。 非对称二甲基精氨酸(Asymmetric Dimethylarginine, ADMA)是一种内源性NOS抑制剂,能竞争性地抑制NO的生成。人体内生成的ADMA 80%经二甲基精氨酸二甲胺水解酶(包括DDAH1和DDAH2两种亚型)水解代谢而失活。因此,体内DDAH酶活性的高低可通过影响ADMA的代谢,从而影响NOS的活性和NO的水平。遗传因素可能是影响体内DDAH酶活性的因素之一。由遗传因素所导致的个体间DDAH酶活性的差异可能通过影响ADMA的体内浓度,从而影响机体对高血压病的易感性。本文通过病例-对照研究,探讨DDAH1基因多态性与中国汉族人群高血压病遗传易感性的关系。 方法 1.候选单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)位点的选择与基因分型 应用NCBI数据库中的数据资源,对中国人群DDAH1基因的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)进行登记,通过连锁不平衡分析,明确该基因区域SNP位点间的连锁不平衡情况,选择待分型的标签SNP (haplotype tag SNP, htSNP)。同时,随机选取20个无亲缘关系的高血压患者,通过PCR产物测序,对该基因所有外显子、外显子-内含子交界以及2kb范围内的启动子区进行重新测序和SNP发掘,寻找新的标签SNP。应用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)的分析方法,在1318例原发性高血压患者和1005例健康人群中对DDAH1基因的标签SNP进行基因分型,并通过应用高效液相色谱-质谱联用法测定病例和对照人群血浆ADMA的水平。 2.荧光素酶报告基因实验对SNP的功能进行验证 对于3’端未翻译区(3'-untranslated region,3'-UTR)出现阳性关联的SNP, PCR扩增含不同等位基因的3'-UTR区段并克隆入荧光素酶报告基因质粒,以pRL-SV40载体为内参,两种质粒混合并转染人脐静脉内皮细胞株HUVECs。双荧光素酶报告实验体系测定荧光素酶活性,分析和比较含不同等位的3'-UTR序列的转录活性。 3.培养的人脐静脉内皮细胞观察SNP的功能 分离和培养人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs), PCR-RFLP对脐静脉组织DDAH1 SNP位点进行基因分型,第4代内皮细胞于24孔板中培养24小时,ELISA法测定细胞内及培养基中ADMA的浓度和DDAH1的活性;应用放线菌酮处理内皮细胞,测定药物处理前(0小时)及药物处理后4、8、12、16、24和36小时DDAHl mRNA表达水平,比较DDAH1不同基因型个体HUVECs DDAH活性、ADMA水平、DDAH1 mRNA表达水平及半衰期的异同。 结果 (1)通过在20个无关中国个体中对DDAH1基因进行重新测序,总共发现了46个SNP,其中有10个为新发现的SNP。所有的46个SNP均不改变DDAH1的氨基酸结构,其中12个位于3'-UTR区。 (2)病例和对照人群中rs233113 A/T、rs3087894 C/G和rs233112A/G多态性位点基因型分布存在显著的差异(P值分别为0.003、0.003和0.042),且rs3087894 C/G和rs233113 A/T多态性呈完全连锁不平衡(D'=1,r2=1);病例和对照人群中rs3813600 C/T多态位点基因型分布差异不明显(p=0.073)。 (3)通过对高血压的风险因素进行校正,Logistic回归分析结果显示,携带rs233113 T(或rs3087894 G)等位的个体患原发性高血压病的风险显著降低(比值比=0.747,95%可信区间:0.618-0.904,P=0.005); rs233112GG基因型也可降低高血压病的发病风险(比值比=0.772;95%可信区间:0.607-0.983,p=0.035);而rs3813600多态位点与高血压病的发病风险不相关(p0.05)。 (4)病例组人群血浆ADMA的浓度显著高于对照人群组(p0.001)。在对照人群中,携带rs233113 T等位的个体血浆中ADMA浓度显著高于基因型为AA的个体(p=0.016),而在病例人群中,rs233113 TT基因型个体血浆ADMA浓度与rs233113 AA基因型个体相比有降低的趋势(p=0.089);对照组中携带rs3813600 T等位的个体血浆ADMA的浓度显著低于该位点基因型为CC的个体(p=0.033),rs233112GG基因型个体血浆ADMA的浓度显著高于该位点为AA基因型的个体(p=0.007);而在病例组中,rs3813600位点携带T等位的个体血浆ADMA的浓度显著高于该位点为CC基因型的个体(p=0.048); rs233112GG基因型个体血浆ADMA的浓度显著低于该位点为AA基因型的个体(p=0.036)。 (5)携带rs233113 T等位的pGL3质粒荧光素酶活性显著高于携带rs233113 A等位的质粒;与rs233113 (A/T)多态性呈完全连锁不平衡的SNP rs3087894 (C/G)/rs233115 (C/T)/rs233114 (A/C)构成的两种单倍型(rs3087894C-rs233115C-rs233114A和rs3087894G-rs233115T-rs233114C)间报告基因的活性无显著差别。 (6)携带rs233113 T等位的HUVECs (n=4)细胞内DDAH的活性显著高于基因型为rs233113 AA的HUVECs (n=5, p=0.039),而细胞内ADMA的浓度显著低于rs233113 AA基因型HUVECs(p=0.037)。放线菌酮处理前及处理后4小时和8小时,携带rs233113T等位的HUVECs (n=4)内DDAH1 mRNA表达水平显著高于基因型为rs233113 AA的HUVECs (n=5,p0.05)。与基因型为rs233113AA的HUVECs (n=5)相比,携带rs233113 T等位的HUVECs (n=4)内DDAH1 mRNA消除半衰期有缩短的趋势(t1/2分别为17.3±3.4h和51.0±31.5h,p=0.073)。 结论 DDAH1基因rs233113A/T和rs233112A/G多态性与中国长沙地区汉族人群原发性高血压的遗传易感性相关,rs233113A/T多态性可通过增加报告基因的活性、DDAH1 mRNA表达和活性,从而降低体内ADMA的水平,降低原发性高血压的易感性。 研究背景 冠心病是人类死亡的主要原因并已成为世界主要卫生问题之一。流行病学调查资料表明,冠心病是由环境因素和遗传因素相互作用所导致的多基因疾病。 血管内皮在维持心血管系统的稳态中起极其重要的作用,内皮功能受损是包括冠心病在内的多种心血管疾病的早期表现。NO能够调控内皮功能且能反映内皮功能的健康状况,其生成减少或活性降低在动脉粥样硬化(Atherosclerosis, AS)和冠心病的发生发展中起到关键作用。 非对称二甲基精氨酸(ADMA)是一种内源性NOS抑制剂,能竞争性的抑制NO的生成。研究表明,血浆ADMA水平和冠心病病变程度间呈强关联。此外,冠心病患者体内活性氧(Reactive oxygen species, ROS)水平显著增加,氧化应激在AS和冠心病的发生发展中起重要作用。研究表明,病理生理浓度的ADMA也可通过增加培养的人脐静脉内皮细胞和脂肪细胞细胞内ROS的生成,从而参与AS的发生发展。 人体血浆中的ADMA主要经二甲基精氨酸二甲胺水解酶1和2(Dimethylarginine Dimethylaminohydrolases, DDAH1和DDAH2)水解代谢而失活。研究表明,遗传因素可能是影响体内DDAH酶活性的因素之一。因此,由遗传因素所导致的个体间DDAH酶活性的差异可能通过影响ADMA的体内浓度以及NO的水平,从而影响机体对冠心病的易感性。本文通过病例-对照研究,探讨DDAH1基因多态性与中国汉族人群冠心病遗传易感性的关系。 方法 1.病例对照标本候选SNP位点基因分型 应用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)的分析方法,在544例冠心病患者和992例健康对照人群中对DDAH1基因的标签SNP进行基因分型。 2.荧光素酶报告基因实验对SNP的功能进行验证 PCR扩增含不同等位基因的3’-UTR区段并克隆入pGL3-Control质粒中,以pRL-SV40载体为内参,两种质粒以及microRNA 218(miR-218)模拟物共同转染人脐静脉内皮细胞株HUVECs。双荧光素酶报告实验测定荧光素酶活性,分析和比较含不同等位的3’-UTR序列在不同浓度的miR-218模拟物处理下的报告基因活性。 结果 (1)冠心病病例组和对照组中rs233113位点AA、AT和TT基因型频率分别为53.5%、37.1%、9.4%和47.3%、43.3%、9.4%,病例组rs233113 AA基因型频率显著高于对照组(P=0.020)。病例组和对照组中rs233112位点AA、AG和GG基因型频率分别为32.8%、50.6%、16.6%和28.9%、49.9%、21.2%,病例组rs233112GG基因型频率显著低于对照组(P=0.036)。 (2)通过对冠心病的风险因素进行校正,Logistic回归分析结果显示,携带rs233113 T等位的个体患冠心病的风险显著降低(OR=0.503,95%CI:0.316-0.801, P=0.004),而携带rs233112 A等位的个体患冠心病的风险显著增加(OR=1.969,95%CI:1.040-3.728,P=0.037)。 (3)冠心病病例组人群血浆ADMA的浓度显著高于对照人群组(p0.05);病例组携带rs233113 T等位的个体血浆中ADMA浓度略低于AA基因型个体;携带rs233112 G等位的个体血浆中ADMA浓度显著低于基因型为AA的个体(p=0.024)。 (4)携带rs233112 A等位的质粒的荧光素酶活性显著高于携带rs233112 G等位的质粒(p0.05), miR-218 (2.5nM-20nM)可显著降低含rs233112 A质粒的荧光素酶活性,而对携带rs233112 G等位的质粒荧光素酶活性无影响。 结论 DDAH1基因rs233113A/T多态性和rs233112A/G多态性可分别降低和增加中国长沙地区汉族人群冠心病的发病风险,rs233112多态位点可影响报告基因活性和miR-218的结合,可能是影响冠心病易感性的功能性SNP位点。 研究背景 冠心病是一种由环境因素和遗传因素相互作用所导致的复杂性多因素疾病。大量的研究结果表明,氧化应激和活性氧(ROS)在动脉粥样硬化(AS)及其并发症的发生发展中起到重要作用。ROS可导致多种活性醛如4-羟基壬烯醛(4-HNE)等生成增加,而活性醛类可进一步加重氧化应激,引起血管内皮功能障碍,促进AS的病理生理过程。 人类线粒体醛脱氢酶(ALDH2)参与多种活性醛类的代谢灭活,其中包括4-HNE。ALDH2基因的第12号外显子上存在功能性单核苷酸序列多态性rs671多态,该SNP使ALDH2多肽第504位的谷氨酸被赖氨酸取代,从而导致ALDH2酶活性降低,代谢乙醛等活性醛的能力下降。 非对称二甲基精氨酸(ADMA)是一种内源性的一氧化氮合酶(NOS)抑制剂,它能够降低NO的生物利用度而导致内皮功能障碍,因此ADMA被视为一种新的冠心病和AS的危险因子。ADMA在体内主要是由二甲基精氨酸二甲胺水解酶(DDAH1和DDAH2)代谢灭活。在培养的内皮细胞中,4-HNE能通过与DDAH1形成Michael加合物而剂量依赖性地抑制]DDAH1活性,进而增加ADMA产生并降低NO生成。 本实验在中国人群中研究了ALDH2 rs671多态性是否与冠心病发病风险相关,并研究该多态是否可影响DDAH1的mRNA表达和ADMA的浓度,从DDAH/ADMA系统探讨其影响冠心病易感性的可能机制。 方法 1.病例对照标本候选SNP位点基因分型 收集冠心病和性别年龄相匹配的健康对照人群血液标本。应用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)的分析方法,对所有病例和对照人群ALDH2基因rs671多态性进行基因分型。 2. ALDH2 rs671多态性对原代人脐静脉内皮细胞血管紧张素Ⅱ处理前后DDAH1/ADMA系统的影响 取11根人脐带进行ALDH2基因分型,分离培养人脐静脉内皮细胞HUVECs。第4代细胞用不同浓度(10-7至10-5mol/L)的血管紧张素Ⅱ处理24小时。应用实时定量PCR法检测细胞内DDAH1 mRNA表达水平。应用高效液相色谱-质谱联用法检测细胞内及培养基中ADMA的水平。 结果 (1)冠心病病例组和对照组中rs671位点GG、GA和AA基因型频率分别为52.5%、41.0%、6.5%和65.0%、30.1%、4.9%,病例组rs671 GA+AA基因型频率显著高于对照组(χ2=13.807,P=0.0002)。通过对冠心病风险因素进行校正,Logistic回归分析结果显示,在总人群中,携带rs671 A等位的个体患冠心病的风险显著增高(OR=1.85,95%CI:1.38-2.49,P=0.00005)。 (2)在病例和对照人群中,不饮酒人群携带rs671 A等位个体的频率均显著高于饮酒人群(病例组中分别为53.7%和28.8%,P=1.1×10-5;对照组中分别为38.8%和22.5%,P=0.003);不饮酒人群中病例组携带rs671 A等位个体的频率(53.7%)显著高于对照组人群(38.8%,P=0.00012)。通过对冠心病的风险因素进行校正,Logistic回归分析结果显示,携带rs671 A等位可显著增加不饮酒人群冠心病的发病风险(OR=1.95,95%CI:1.40-2.70, P=0.00007),但不影响饮酒人群冠心病的发病风险(OR= 1.56,95%CI:0.77-3.18, P=0.22)。 (3)在不饮酒健康人群,rs671 AA纯合子个体血清高密度脂蛋白(HDL-C)浓度(1.20±0.22 mmol/L, n=22)显著低于GG纯合子个体(1.39±0.36 mmol/L, n=212, P=0.015)。 (4)基因型为rs671 GG的HUVECs (n=6) DDAH1 mRNA表达水平显著高于基因型为rs671 GA的HUVECs (n=5) (p<0.05),而细胞内ADMA水平显著低于基因型为GA的HUVECs (p<0.05)。高浓度的血管紧张素Ⅱ(10-5mol/L)可显著降低基因型为rs671 GG的HUVECs中DDAH1 mRNA表达,升高该基因型HUVECs细胞内ADMA浓度,但对基因型为GA的HUVECs DDAH1 mRNA表达和ADMA浓度影响不明显(p0.05)。 结论 ALDH2基因rs671多态性可能通过降低HDL-C水平和HUVECs内DDAH1的mRNA表达,升高HUVECs内ADMA的水平,从而增加不饮酒的中国长沙地区汉族人群冠心病的发病风险。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 成育玲;;某医院冠心病知识健康教育评估[J];职业与健康;2011年22期
2 马淑红;凌娇奴;;川穹素治疗冠心病35例[J];内蒙古中医药;2011年20期
3 宋杰;张译心;白晶;;血清胆红素与冠心病的关系探讨[J];现代中西医结合杂志;2011年34期
4 申铁梅;陈凌;杨满青;林丽霞;;冠心病患者自我管理能力与焦虑、抑郁的相关性研究[J];岭南心血管病杂志;2011年S1期
5 吴忠;王圣;乔平;廖旺;吴清柳;吴明;;背向散射积分评价冠心病患者颈动脉内中膜病变[J];岭南心血管病杂志;2011年S1期
6 乐人;;冠心病患者:您的心血管需要“特护”[J];开卷有益(求医问药);2011年09期
7 曾祖荫;吴正潭;杜可贤;潘启义;阳洪奇;;心放射图中β角对冠心病诊断价值的探讨[J];贵州医药;1984年05期
8 佟万仁;刘廷茂;王作尧;郭躬太;刘玲爱;牛淑洁;;76例冠心病患者的心脏收缩时间间期的改变[J];吉林医学;1984年05期
9 苏国达;;29例非胰岛素依赖型糖尿病NIDDM的糖、脂及氧化代谢紊乱与冠心病的关系[J];云南医药;1986年02期
10 刘春兰;蒙传文;;用耳垂折痕预测冠心病临床观察[J];河北北方学院学报(医学版);1990年02期
11 孙银香;张燕华;李汇川;柯元南;;A型行为与冠心病关系的探讨[J];中日友好医院学报;1990年02期
12 蔡雅明;白静;;夜间病情观察对冠心病患者尤为重要[J];护理学杂志;1991年04期
13 邓世周;;静滴丹参液对31例冠心病患者血液流变学的影响[J];海军医学杂志;1992年04期
14 陈朝东;杨桂英;曾志羽;李浪;梁世坤;;蝮蛇抗栓酶治疗冠心病[J];蛇志;1992年03期
15 祝向红;;益气宣痹通脉汤治疗冠心病30例[J];江西中医学院学报;1992年01期
16 孙宝全;章茜;;胆囊病与冠心病的关系[J];河南医学研究;1992年02期
17 郑武军;;冠心病患者的心理康复[J];医学与哲学(人文社会医学版);1992年12期
18 刘来华,米宝发,刘守泉;PSS对冠心病患者的血液流变学影响[J];中国血液流变学杂志;1993年02期
19 王天顺,王秋生;冠心病患者的衣食住行[J];家庭医学;1996年04期
20 刘向阳,李文腾,王华君;冠心病患者的心率变异性分析[J];山东医药;1997年05期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 任桂芝;修运强;蔡智荣;林淑美;张宁宁;朱霞;;心电频谱图对冠心病早期诊断价值的探讨[A];第二届全国心功能学术研讨会论文摘要汇编[C];1990年
2 李定良;巫相宏;;冠心病患者趋化因子CXCL16的水平测定及临床意义[A];第十三次全国心血管病学术会议论文集[C];2011年
3 王莉娜;智宏;朱一;张钰;成浩;张学宁;张珍;王蓓;;miRNAs相关基因变异与冠心病发生及预后的关联研究[A];华东地区第十次流行病学学术会议暨华东地区流行病学学术会议20周年庆典论文汇编[C];2010年
4 李烨;孙兰军;;孙兰军教授运用药对治疗冠心病[A];第十次中国中西医结合学会心血管病学术大会暨第五次江西省中西医结合学会心血管病学术大会论文汇编[C];2010年
5 王齐齐;邱原刚;;2000和2006年冠心病患者危险因素变化趋势[A];2007年浙江省心电生理与起搏学术年会论文汇编[C];2007年
6 陈锁平;吕继有;;中医治疗冠心病临床疗效观察[A];第四届全国心功能学术研讨会论文摘要集[C];1994年
7 张静云;王玲;;冠心病频域心电图与心电图阳性率对比分析[A];第二届全国心功能学术研讨会论文摘要汇编[C];1990年
8 代芬;张艺;;冠心病介入术前后患者的焦虑情绪及心理干预[A];第十三次全国心血管病学术会议论文集[C];2011年
9 徐传和;;绝经后妇女冠心病患者血脂谱检测结果分析[A];中华医学会第九次全国检验医学学术会议暨中国医院协会临床检验管理专业委员会第六届全国临床检验实验室管理学术会议论文汇编[C];2011年
10 张叶萍;顼志敏;刘红;陈国良;谢爽;段兵;黄一玲;李一石;;冠心病患者载脂蛋白AⅠ、Ⅳ及血浆淀粉样蛋白A水平的变化[A];第十三次全国心血管病学术会议论文集[C];2011年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 郭亦杰;DDAH1和ALDH2基因多态性与高血压及冠心病易感性的关联关系及机制研究[D];中南大学;2010年
2 张秀锦;内源性雄激素、雄激素受体水平及雄激素受体CAG重复序列多态性与老年男性冠心病的相关性研究[D];中国人民解放军军医进修学院;2010年
3 孙贵香;冠心病中医证候数据库系统的构建及其BP神经网络模型的研究[D];湖南中医药大学;2008年
4 Cyprien MBA MBA(恩巴);大剂量多巴酚丁胺负荷试验结合二维应变成像早期诊断冠心病的价值[D];华中科技大学;2011年
5 汪奇;CT冠状动脉造影结合心肌灌注显像指导冠心病诊疗的临床研究[D];中国人民解放军军医进修学院;2010年
6 徐伟;急性冠脉综合征与稳定性冠心病“瘀毒”表征的比较研究[D];北京中医药大学;2010年
7 屈岚;三种不同肤色人种冠心病中医证型临床流行病学调查[D];湖南中医药大学;2011年
8 王钰;体外心脏震波(CSWT)治疗冠心病的疗效、安全性和方法学研究[D];昆明医学院;2010年
9 方叶青;冠心病患者EPC的变化及LPS和罗格列酮干预EPC后纤溶和炎症因子变化的研究[D];中南大学;2008年
10 李耀辉;从气血相关和“通则不病”探讨冠心病微血管新生机理的实验研究[D];北京中医药大学;2010年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 徐建;血浆内皮脂酶水平与冠心病的发病关系的研究[D];浙江大学;2010年
2 严建军;Visfatin启动子区基因多态性与冠心病相关性研究[D];南京医科大学;2010年
3 邢燕;老年、青年冠心病患者危险因素及冠脉造影结果分析[D];辽宁中医药大学;2010年
4 吴志勤;血清脂蛋白a与冠心病的相关性研究[D];重庆医科大学;2011年
5 张涛;冠心病患者调脂治疗中胆固醇代谢标志物动态变化的研究[D];南华大学;2010年
6 张伟伟;冠心病患者血浆PZ水平的检测及临床意义[D];中南大学;2010年
7 严鸿雁;282例冠脉造影患者血尿酸水平与冠心病的相关性研究[D];新疆医科大学;2010年
8 曹蕊;冠心病患者中医舌象与冠脉病变程度及生化指标的相关性研究[D];黑龙江中医药大学;2010年
9 龚厚文;冠心病患者局部左心功能与B型利钠肽变化的相关性研究[D];泸州医学院;2010年
10 何德全;冠心病患者γ-谷氨酰基转移酶与脉搏波传导速度及血管内皮功能的相关性研究[D];汕头大学;2010年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 王泽;34%冠心病患者长期吸入二手烟[N];中国消费者报;2007年
2 温馨;烟民在家中抽烟家人患冠心病风险增加四倍[N];大众科技报;2007年
3 胡春松 胡大一;冠心病防治:以HE为重 以Se为先[N];健康报;2007年
4 宋丽华;冬季,冠心病患者7注意[N];中国中医药报;2007年
5 健康时报特约记者 吴志;假期防心梗有四招[N];健康时报;2010年
6 复旦大学附属华山医院心内科 戴瑞鸿 终身教授;心脏真的可以自己“搭桥”吗?[N];上海中医药报;2010年
7 上海市仁济医院心内科 主任 何奔;冠心病患者自我保健[N];上海中医药报;2008年
8 文都;冠心病患者治疗腹泻有说道[N];大众科技报;2005年
9 于斌;冠心病患者别吃入误区[N];大众卫生报;2004年
10 朱国英;冠心病防治中把握住“ABCDE”[N];农村医药报(汉);2008年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978